一种血液游离DNA文库的构建方法

摘要

本发明公开了一种血液游离DNA文库的构建方法，包括末端修复，磁珠纯化，接头连接，磁珠筛选、纯化，文库混合，文库扩增、磁珠纯化等步骤。本发明方法与以往的基于Ion Proton^TM平台的建库方法相比，不需要提取游离DNA，同时采用Biocanal Magbeads磁珠，步骤简单，成本低，降低了文库的损失，减少了GC扩增偏好，提高了建库成功率，同时可提高后续检测结果的准确度。

主权项

一种血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)末端修复：将孕妇外周血的血浆与末端修复试剂和末端修复酶混合进行反应；(2)磁珠纯化：将步骤(1)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到纯化后的DNA片段；(3)接头连接：将步骤(2)所得到的DNA片段与连接酶、聚合酶、连接反应缓冲液、接头、标签接头混合进行接头连接反应；(4)磁珠筛选、纯化：将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠筛选大小和纯化得到DNA文库；(5)文库混合：QPCR检测文库浓度，不同样本进行等浓度混样；(6)文库扩增、磁珠纯化：将步骤(5)得到的混合文库加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再进行磁珠纯化得到游离DNA文库；其中，步骤(1)中所用的末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris‑HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl₂、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶；步骤(2)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；步骤(3)中所用连接酶为400U/ul的T₄ DNA Ligase，聚合酶为8U/μl的Bst WarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM pH8.0的Tris‑HCl，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄；步骤(4)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；步骤(6)中所用扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot Start High‑Fidelity DNA polymerase、66mM pH8.9的Tris‑SO₄、20mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄、220μM的dNTPs混合液；步骤(6)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠。