一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，该方法可以实现在一个待测样本中同时检测草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便，特异性强，检测灵敏度和准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。

主权项

一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测的试剂盒，包括如下成分：双重荧光定量反应液、酶混合液、RT‑PCR 反应液、阳性质控品和无RNA 酶去离子水，其特征在于：所述双重荧光定量反应液中含有草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型特异性引物及探针，序列分别为：草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型：上游引物：GCRV‑Ⅰ‑F：5’‑CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC‑3’；下游引物：GCRV‑Ⅰ‑R：5’‑CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG‑3’ ；荧光探针：GCRV‑Ⅰ‑P：5’‑FAM‑CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA‑BHQ1‑3’；草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型：上游引物：GCRV‑Ⅱ‑F：5’‑TGATGAGTTCAGTGCCTACG‑3’；下游引物：GCRV‑Ⅱ‑R：5’‑GAGCCATGAGGTGTGTCTAC‑3’；荧光探针：GCRV‑Ⅱ‑P：5’‑CY5‑ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT‑BHQ1‑3’；草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型的荧光探针报告基团为FAM，草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ1；所述双重荧光定量反应液的组成如下：100μM的 GCRV‑Ⅰ‑F              5μL100μM的 GCRV‑Ⅰ‑R              5μL100μM的 GCRV‑Ⅰ‑P              4μL100μM的 GCRV‑Ⅱ‑F              6μL100μM的 GCRV‑Ⅱ‑R              6μL100μM的 GCRV‑Ⅱ‑P              5μL无RNA酶去离子水                 169μLTotal                            200μL；所述酶混合液包括逆转录酶和Taq 酶；所述阳性质控品为灭活的草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型GCRV09‑01株和Ⅱ型GCRV‑HZ08株的培养液。