基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，在洗净的金电极上滴加捕获探针，冰箱中过夜后取出封闭，在金电极上滴加待测样品，反应完后再滴加环化DNA，反应，滚环扩增，再加入金纳米探针，杂交，进行DPV信号检测。本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合滚环扩增与金纳米技术，利用电化学技术检测沙门菌invA基因，灵敏度上有了极大的改善，使得检测的线性范围达到100aM～10pM，灵敏度为：100aM。污染牛奶中沙门菌检测范围为20～6×10⁸CFU mL^-1的沙门菌，最低检测限为20CFU mL^-1。本发明构建了快速和超灵敏检测沙门菌的方法，极大提高了检测的灵敏度，具有检测设备小型化、简便快速和检测成本低的特点。

主权项

一种用于非诊断目的的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：1）将裸金电极抛光, 洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15 min，再取出清洗、干燥；2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4 ℃冰箱中过夜；3）将步骤2 中的金电极取出，冲洗，用6‑巯基‑1‑己醇封闭1～1.5 h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA 和2 % BSA 混合溶液封闭金电极30～40 min；4）将步骤3 中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37 ℃反应1～1.5 h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37 ℃反应1～1.5h；5）将步骤4 中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi 29 DNA 聚合酶的滚环扩增反应液，37 ℃滚环扩增1～1.5 h；6）将步骤5 中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC 杂交液配制的金纳米探针，37 ℃杂交1～1.5 h，用DEA 缓冲液清洗电极；7）在步骤6 中的金电极上加入含有0.8 % BSA 的DEA 缓冲液配制的1.25 μg/mL的ST‑AP，37 ℃反应30～45 min，用DEA 缓冲液冲洗后，置入用DEA 缓冲液配制的0.75 mg/mL 的α‑NP 底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV 信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度；所述的巯基标记的捕获探针序列为：5’‑SH‑(CH₂₎₆– TTTTTTTTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC‑3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为：5’‑SH‑(CH₂₎₆‑TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT‑biotin‑3’，制作环化DNA 时所用的待环化模板DNA 序列为：5’‑p‑CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATGTCCTATC‑3′，探针2 序列为：5’–AATACTCATCTGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT‑3’。