检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法

摘要

本发明公开了检测口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法(FMD NSP B-ELISA)，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6×组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率，适于检测牛、羊与猪等多种易感动物血清。

主权项

检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过2C多抗将原核表达的口蹄疫病毒2C3AB非结构蛋白捕获于酶标板；所述血清稀释液：含10％马血清，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液；所述25倍浓缩洗涤液：500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl5g、Na₂HPO₄·12H₂O72.5g、KH₂PO₄5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH为7.4，高压灭菌，室温存放备用；所述底物溶液：为单组份3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺(TMB)底物；所述100×浓缩酶标检测抗体：为辣根过氧化物酶标记的口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中₂₄GPYAGPMER₃₂位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备；所述终止液：0.3M H₂SO₄溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成；所述阳性对照血清：采自口蹄疫病毒感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；所述阴性对照血清：采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存；检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，步骤：A1、于血清稀释板中，将待测血清按1∶5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温过夜振荡作用18‑24h；A2、次日，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；A3、将100×浓缩的酶标抗体1∶100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用1小时；A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10‑15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD₆₅₀值接近0.7时终止反应，检测效果最佳；A5、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD₄₅₀)；A6、阻断率计算：阻断率(PI)＝1‑样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀；A7、试验成立的条件：阴性对照OD₄₅₀值‑阳性对照OD₄₅₀值≥0.8，且阳性对照阻断率应≥60％；A8、判定标准：牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0.46判为非结构蛋白2C3AB抗体阳性，血清阻断率小于0.46判为非结构蛋白2C3AB抗体阴性。