MUC1和IL-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种MUC1和IL-2双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有MUC1基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接MUC1基因和IL-2基因，能够在同一载体中同时表达人上皮粘蛋白以及人白细胞介素-2，该重组载体可用于肿瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地产生特异性抗肿瘤效应。

主权项

MUC1和IL‑2双基因共表达重组载体pIRES2‑MUC1‑IL‑2的制备方法，包括以下步骤：a)获得含有特异性酶切位点的MUC1基因片段：从乳腺癌细胞MCF‑7获取cDNA作为模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位点序列的MUC1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位点的MUC1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；b)构建pIRES2‑MUC1‑EGFP重组载体：用限制性内切酶Bgl II、EcoR I分别酶切pIRES2‑EGFP质粒以及步骤a)得到的MUC1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2‑MUC1‑EGFP重组载体；c)获得含有酶切粘性末端的IL‑2基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL‑2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL‑2基因片段混合物，其中的一种IL‑2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；d)构建pIRES2‑MUC1‑IL‑2重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤b)得到的pIRES2‑MUC1‑EGFP重组载体，将步骤c)得到的IL‑2基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2‑MUC1‑EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2‑MUC1‑IL‑2重组载体；其中，步骤a)所述的MUC1特异性引物为：MUC1上游引物：5’‑GAAGATCTATGACACCGGGCACCC‑3’，MUC1下游引物：5’‑TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG‑3’；步骤a)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；步骤c)所述的IL‑2特异性引物包括IL‑2第一引物对和IL‑2第二引物对，所述的IL‑2第一引物对由IL‑2上游长引物和IL‑2下游长引物组成，所述的IL‑2第二引物对由IL‑2上游短引物和IL‑2下游短引物组成：IL‑2第一引物对为：IL‑2上游长引物：5'‑AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT‑3'，IL‑2下游长引物：5'‑GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT‑3'；IL‑2第二引物对为：IL‑2上游短引物：5'‑ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT‑3'，IL‑2下游短引物：5'‑GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC‑3'；步骤c)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；步骤c)所述杂交PCR反应的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，4℃保存。