一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法

摘要

本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。本发明的方法具有更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用的优点。

主权项

一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1‑hCas9‑NLS；(2)、构建gRNA表达载体pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA；(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA中；(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1‑hCas9‑NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。