一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，它包括样品的前处理与制备、微生物胞内多聚磷酸盐含量测定、菌体总蛋白测定和微生物胞内多聚磷酸盐poly P的定量。与现有技术相比，本发明样品前处理及反应过程简单，样品需求量极小且可同时检测多个样品。同时，本发明方法中poly P的最低检测限可达ng级，对于基础科研意义重大。

主权项

一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品的前处理与制备：将待测微生物接种于废水培养基中培养，取菌液测其OD₆₀₀，测完后将菌液离心后弃去上清液，用HEPES缓冲液重悬菌体，离心后弃去上清液，得到待检测样品；(2)微生物胞内多聚磷酸盐含量测定：(2a)将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液混合后立刻涡旋混匀，孵育后再次涡旋混匀，继续孵育，得到样品组混合液；(2b)用超纯水代替DAPI染液，重复(2a)中的操作，得到样品对照组混合液；(2c)将样品组混合液与样品对照组混合液分别按每孔200μl的上样量上样至96孔板；(2d)将步骤(2c)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于415nm处激发，于550nm处测定其荧光强度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于poly P标准曲线中读出样品中poly P的含量Y_P；(3)菌体总蛋白测定：(3a)将待检测样品上样至96孔板，加入DC Protein Reagents Package试剂盒中所提供的Reagent A，轻轻混匀，15‑25℃下孵育5min后加入试剂盒中所提供的Reagent B，立刻吸吹混匀，显色15min后，得到样品组混合液；(3b)用HEPES代替待检测样品，重复(3a)中的操作，得到样品对照组混合液；(3c)将步骤(3a)和(3b)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于750nm处测定其吸光度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于BSA标准曲线中读出样品中蛋白的含量Y_A；(4)微生物胞内多聚磷酸盐的定量获得Y_P值和Y_A值后，按以下公式将微生物胞内的多聚磷酸盐含量准确定量，最终定量的单位为：μg(磷)/mg(菌体蛋白)；其中，微生物胞内多聚磷酸盐poly P含量：T_PP＝30.9738Y_P/Y_A。