一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法，包括胎盘的组织分离、组合酶消化、不连续梯度密度分离、免疫磁珠分选、间充质前体干细胞的悬浮培养；其特征在于具体步骤如下：胎盘组织分离：无菌收集胎盘，常规方法；组合酶消化；用2~5LPBS或αMEM稀释，并用200目滤网过滤组织残渣；不连续密度梯度分离；加入神经营养因子受体鼠抗人CD271单克隆抗体，通过磁场分选柱进行分选，收集洗脱被标记的细胞；胎盘前体干细胞培养；每2-3天添加新鲜培养基；10-14天可见胎盘前体干细胞呈拟胚体样球形生长。其获得的间充质前体干细胞表达间充质干细胞的标志，还表达神经干细胞的标志巢蛋白（Nestin）和CD271；自我更新能力、分化能力更强，具有更广泛的应用前景。

主权项

一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法，包括胎盘的组织分离、组合酶消化、不连续梯度密度分离、免疫磁珠分选、间充质前体干细胞的悬浮培养；其特征在于具体步骤如下：胎盘组织分离：无菌收集胎盘，常规方法，用有齿镊和手术刀分离绒毛膜和羊膜，PBS冲洗绒毛膜及血管，并剪成2mm×2mm碎片；组合酶消化：胶原酶Ⅰ和组织分散酶Ⅱ，37℃震荡消化1~6小时，再用胰蛋白酶消化0.5~1小时；用2~5L PBS或αMEM稀释，并用200目滤网过滤组织残渣；不连续密度梯度分离：用10%~50% Percoll液，密度梯度2500rpm 离心20min，吸取20%‑30%Percoll之间的单个细胞，PBS离心洗涤2次；加入神经营养因子受体鼠抗人CD271单克隆抗体，孵育30min，PBS洗涤2次，1500rpm离心5min；加入磁珠标记二抗抗鼠IgG1，2‑8℃孵育15min，PBS洗涤2次，1500rpm离心5min；通过磁场分选柱进行分选，收集洗脱被标记的细胞；胎盘前体干细胞培养：用神经干细胞基础培养基重悬分离的细胞，加入胎盘间充质前体干细胞培养基即2%B27，bFGF 10ng/ml，EGF 10ng/ml，肝素 20ng/ml，采用超低粘附细胞培养皿培养；37℃，5%CO₂，饱和湿度培养；每2‑3天添加新鲜培养基；10‑14天可见胎盘前体干细胞呈拟胚体样球形生长。