| 主权项 |
一种利用小麦成熟胚培养进行小麦遗传转化的方法，其特征在于如下步骤：(1)将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75％酒精处理3‑5分钟，无菌水冲洗1‑3次，0.1％升汞溶液处理7‑15分钟，最后用无菌水冲洗3‑5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14‑18h，备用；(2)在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d～50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；(3)选取冬小麦或春小麦分生组织团进行遗传转化，即：基因枪轰击前4‑6h将小麦分生组织团接入高渗培养基，在1100psi/6cm或1350psi/9cm条件下轰击，轰击后继续在高渗培养基上处理16～18h；(4)将步骤(3)转化后的材料接入筛选培养基中，培养30‑60d，得到再生抗性幼芽；(5)将步骤(4)得到的抗性幼芽少量进行GUS染色，鉴定转基因是否成功，将大量抗性幼芽接入生根筛选培养基中，直至得到生根苗；(6)将步骤(5)得到的生根苗中的冬小麦进行春化处理，即在4℃下处理15‑25d，对春小麦无需进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽，得到抗性植株；(7)对步骤(6)获得的抗性植株进行GUS染色或进行PCR扩增或除草剂抗性检测以鉴定是否为转基因植株；步骤(7)中所述的PCR扩增方法为：上游引物：5'‑CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA‑3'，下游引物：5'‑CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG‑3'；反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环；后随退火温度递减2度重复3个循坏即：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环，至退火温度为44℃，重复16个循环；72℃继续延伸5min；10℃保温1h；步骤(7)中所述的除草剂抗性检测方法为：用含有200mg/L草丁膦的水溶液涂抹抗性植株叶片的两面，将6d后转基因植株保持绿色或仅叶尖部位呈黄色的植株选留，将叶片尖端至叶中明显变黄的非转基因植株剔除；上述步骤(2)至(5)中的培养基组分及配比为：诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4‑D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；高渗培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4‑D+0.4mol/L甘露醇，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；筛选培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲+5mg/L草丁膦，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至；5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用；生根筛选培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸+2mg/L草丁膦，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用。 |
