一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用，该发明利用从人参、西洋参、三七中提纯的活性分子，调整重组人干扰素γ的空间构象，以获得免疫细胞活化试剂。这种细胞因子与人的CD3单抗配合，可以在体外刺激并活化人体免疫细胞。这种活化所得的免疫细胞能够100％的杀灭癌细胞，并能观察到明确的免疫细胞附着杀伤现象。

主权项

一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤：a、将五加科植物人参、西洋参、三七三种五加科植物之一或其组合作为原药清洗、切片、晒干后，将其与无水乙醚溶液按固液比1∶2～5置于密封容器中，常温浸泡12天～32天，得到浸提液；b、将浸提液用纱布过滤以去除杂质，在不大于33℃的情况下用旋转蒸发仪蒸出乙醚溶液得到浓缩液，亦或是在自然环境下通过乙醚挥发而得到浓缩液；c、将浓缩液与解离溶液按体积比1∶2～3混合萃取，当分层的乙醚挥发消失，溶质完全溶解于解离溶液中，获得溶液A，以解离溶液作为空白对照，测定并记录溶液A在278nm波长下的吸光度值M，并用220um滤膜过滤除菌，得到溶液A′，其中，所述解离溶液含L‑甘氨酸、L‑精氨酸和N‑甘氨酰‑L‑谷氨酰胺，并用盐酸滴定至pH4.8；对溶液A′取样，并根据其在278nm下的吸光度值M，用pH为7的等渗磷酸盐缓冲液稀释至吸光度值等于0.01后，用家兔做多点皮试，如皮试结果为阴性则溶液A′属合格品；d、解离变构：(d1)根据溶液A′在278nm波长下的吸光度值M，将步骤c的解离溶液滴入溶液A′进行稀释，直至溶液A′被稀释至吸光度值等于0.003，并于4～8℃下轻柔搅拌，得到溶液B；(d2)取重组人干扰素γ或由人体免疫细胞分泌的干扰素γ按一定比例逐滴加入溶液B中，并轻柔搅拌5分钟，制得溶液C，这里的计算比例为：每毫升解离溶液配比干扰素800～6000万IU；(d3)将溶液C注入规格为：宽11.5mm，容积1ml/cm，截留分子量为10000的透析袋中，不留空隙，并扎紧透析袋，避免渗漏，然后将透析袋悬垂于4～8℃的复性溶液中，复性溶液体积为透析袋内溶液体积的50倍，轻柔搅拌，4小时后更换新鲜复性溶液，过夜，待透析袋内溶液pH平衡至7.2，使干扰素γ复性；e、吸取步骤d3中透析袋内的溶液，直接滴注于凝胶过滤层析柱中，开始层析分离；层析柱高1米，选用凝胶SephadexG‑25或G‑50，层析柱置于4℃中，采用复性溶液作为洗脱液，自动部分收集器收集B峰流出液，测定B峰流出液在280nm下的吸光度值N，用复性溶液按比例将B峰流出液稀释至浓度为Q的溶液D，然后用220um的灭菌针尖滤器对溶液D过滤除菌，制得变构的干扰素γ；f、组合成活化人体免疫细胞的试剂：活化人体免疫细胞的试剂包括变构的干扰素γ和anti‑CD3，利用两种细胞因子的共同刺激以激活免疫细胞。