一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法

摘要

本发明提供一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，主要涉及分析生物化学技术领域，本发明主要设计了一对引物P1，引物序列为：上游引物F：5'—CGTGCCCAA CGAACTCTT—3' ；下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3'，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鸭DNA特异性地扩增出约523bp的PCR条带，再通过PCR—RFLP技术，最终观察酶切结果。本发明所提供的标记方法具有快速、灵敏、特异等优点，可在家鸭、番鸭和半番鸭群体上提供一种可靠的鉴定方法。

主权项

一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其特征在于：在含SNP酶切位点的鸭MC1R基因编码区设计一对P1引物，引物序列为：上游引物F： 5'— CGT GCC CAA CGA ACT CTT— 3' ；下游引物R： 5'— CAG GGC GAA CAT GTG GA —3' ；其具体步骤包括：对鸭子采用颈静脉采血，EDTA抗凝，‑20℃保存；基因组DNA试剂盒提取总DNA，端粒酶TE溶解，‑20℃保存备用；利用已设计好的引物上游引物： 5'—GCC AGT GAG GGC AAC CAG AG—3' ；下游引物： 5'— CTA CCA GGA GCA CAG CAC CA —3'，分别对家鸭、番鸭和半番鸭的DNA进行扩增；产物回收、克隆并正反向测序；应用DNAStar中的SeqMan软件对测序结果进行比对，搜索SNP；（3）引物的设计在含SNP酶切位点的鸭MC1R基因编码区设计一对引物P1，上游引物F与下游引物R；（4）PCR扩增利用引物P1对番鸭、半番鸭和家鸭基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为: 2 × Taq MasterMix 12.5μL，上游引物F 1μL，下游引物R 1μL，模板 DNA 2μL ，补充ddH2O 至终体积25μL；PCR 反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55.5℃ 35 s，72℃ 40 s，共 35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存；PCR 产物经质量分数为 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；（5）PCR‑RFLP检测取扩增产物5‑6μL，加入限制性内切酶Hin6Ⅰ1μL，10×Buffer 1μL，加ddH₂O至终体积10μL，37℃酶切反应过夜，酶切产物用质量分数为3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000 DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio‑Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型；（6）结果利用引物P1对3类鸭群体进行扩增、克隆测序比对，发现A399G位于限制性酶切Hin6Ⅰ的识别位点，1个可用PCR‑PFLP方法检测SNP的鸭MC1R基因标记，即为鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法。