猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒。试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阻断抗体，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B，终止液。该试剂盒的检测板为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原包被的可拆卸96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，阻断抗体为兔抗猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白多克隆抗体。本发明有益的积极效果是：特异性强、灵敏度高、操作简单，适合于临床大规模推广应用，具有广阔的市场前景。

主权项

一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于：包括抗体检测板，酶结合物工作液，样品稀释液，显色液A，显色液B，终止液；阻断抗体，洗涤液；所述的阻断抗体为使用纯化后的猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白免疫家兔后，从家兔体内获得的多克隆抗体；所述酶结合物工作液为：商品化的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，进行1∶10000稀释的稀释液，酶标二抗直接加入酶标二抗稀释液中，酶标二抗稀释液为：KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 29g，KCl 0.2g，PEG6000 40g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％硫柳汞，调pH至7.4；所述样品稀释液为：KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 29g，KCl 0.2g，PEG6000 40g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％叠氮钠，调pH至7.4；所述显色液A为：0.2mol/L Na₂HPO₄ 51.4ml，0.1mol/L柠檬酸48.6ml，用HCl调pH值至5.0～5.4，加30％H₂O₂ 67μl；所述显色液B为：TMB 50mg，加无水乙醇5ml，搅拌溶解后加0.1mol/L柠檬酸5ml，0.1mol/L EDTA 0.5ml，加ddH₂O定容至100ml；所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液；所述抗体检测板为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原包被的可拆卸96孔酶标反应板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，阻断抗体为兔抗猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白多克隆抗体；所述阻断抗体的制备：使用纯化后的PCMV gB优势抗原表位区蛋白与弗氏佐剂制成油乳剂，对体重在2kg左右的健康公兔进行免疫，使其产生抗体；第一次免疫取1mL纯化产物，与1mL完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；14天后进行第二次免疫，取2mL纯化产物与2mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第三次免疫，取3mL纯化产物与3mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第四次免疫，取0.5mL纯化产物注射入耳缘静脉免疫家兔；一周后无菌采取心血，分离出的血清即为阻断抗体；所述猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原的制备方法为：选择猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B(gB)基因ORF中一段优势抗原表位区的270个碱基序列，进行密码子优化以后，在invitrogen公司合成优化后的基因序列，而后将其克隆到pET32a(+)表达载体，并分别转化到受体菌DH5α和Rosetta(DE3)中，将两株重组菌分别命名为：大肠埃希氏菌DH5α‑pET‑gB株和大肠埃希氏菌Rosetta‑pET‑gB株，将Rosetta‑pET‑gB经IPTG诱导表达，经裂解、纯化后获得，所述猪巨细胞病毒囊膜糖蛋自B(gB)基因在GenBank中的编号为FJ595497.1；所述抗体检测板的制备方法为：使用pH＝9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的gB优势抗原表位区蛋白作为抗原按照1∶320的体积比例稀释后，每个样孔加入100μL抗原，置于4℃10～20h，进行包被，使用样品稀释液覆盖后抽空封装，置4℃保存；检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)将10×洗涤缓冲液加入ddH₂O稀释成1×洗涤工作液，将阻断抗体用样品稀释液进行1600倍稀释，将待检样品进行1∶5稀释；2)在抗原包被板上设定阻断抗体对照孔，加入阻断抗体，每孔100μl；3)将待检样品加入检测样孔中，每孔100μl，封装于封口袋中37℃孵育1.5h；4)将各样孔中的液体倒掉后用1×洗涤工作液洗涤，每孔300μl，洗涤4次，每次2min；5)将稀释后的阻断抗体加入检测样孔，每孔100μl，封装于封口袋中37℃孵育1h，重复步骤4)；6)加入酶标二抗工作液，每孔100μl，封装于封口袋中37℃孵育40mim，重复步骤4)；7)每孔按顺序加入显色液A 50μl，再向每孔中加入显色液B 50μl，室温显色10min；8)每孔按顺序加入终止液50μl终止反应，450nm单波长测定OD值，计算抑制率；9)检测样品的判断标准为：根据样品的抑制率判断猪巨细胞病毒抗体为阴性或阳性。