一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法

摘要

本发明一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，所述赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）SC02，于2012年10月19日保藏于典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414，将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶，本方法可高效的具有很好的应用前景。

主权项

一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌所产的氨基甲酸乙酯水解酶的方法，其特征在于将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)为SC02，该菌株于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2012414；所述强阴离子柱为Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液I为20mM PBS，pH7.0，洗脱缓冲液I为含有1M NaCl的起始缓冲液I，调节pH值为7.0，洗脱条件为：20％洗脱缓冲液I、100％洗脱缓冲液I线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化；所述疏水柱采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液II为20mM PBS，pH7.0，洗脱缓冲液II为含有1M(NH₄)₂SO₄的起始缓冲液II，调节pH为7.0，洗脱条件为：100％洗脱缓冲液II、80％洗脱缓冲液II和0％洗脱缓冲液II梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80％洗脱缓冲液II洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化；所述高分辨率离子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液III为20mM PBS，pH7.0，洗脱缓冲液III为含有1M NaCl的起始缓冲液III，调节pH值为7.0，洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0％‑100％洗脱缓冲液III分别收集各峰并测定酶活；所述凝胶柱采用Superdex‑200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS‑PAGE分离。