一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法

摘要

本发明公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列SEQ NO：1通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rb1为Rd的能力，该酶在90℃、pH4.8的条件下酶活最高，在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min可将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，该极耐热糖苷酶性质优异，可应用于苷元类物质的酶法转化。

主权项

一种极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb1为Rd中的应用，其特征在于，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP_004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列；该极耐热糖苷酶基因克隆到pET‑28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET‑28a‑bg1；所述重组质粒pET‑28a‑bg1的制备方法为：步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为：P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTTCGGCGTGGCGTAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；P2：CCCCTCGAGCATCATCGTAGTTGGTAGTTGTGAAAGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET‑28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET‑28a‑bg1；极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为：将重组质粒pET‑28a‑bg1转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37℃，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶；极耐热糖苷酶的定性为：在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70‑100℃、pH 4.8‑8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L；该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rb1的转化时，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min，可将99％人参皂苷Rb1转化为Rd。