一种原代鸡肝细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，灌流液A中加入肝细胞毒性小的EGTA松散了肝细胞间连接，提高了所分离肝细胞离散程度，灌流液A、灌流液B及D-Hanks冲洗液液中加入双抗，进一步防止污染的发生，消化灌流时采用循环灌流消化，大大节约了灌流成本；建立了鸡肝细胞的无血清培养方法，使其与传统的血清培养方法相比，在细胞数量、活力和功能等方面，达到同样的效果，从而解决了血清的存在带来的种种弊端，为以鸡肝细胞培养为基础的物质代谢研究及生物产品制备奠定了基础。

主权项

一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将取得的鸡肝脏使用添加有2%双抗的D‑Hanks溶液浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液A 8分钟‑10分钟，然后灌注37℃预热的灌流液B 5分钟‑8分钟；其中，所述的灌流液A配方为：15mmol/L HEPES，127.8mmol/L NaCl，3mmol/L KCl，0.7mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，并添加有0.6mmol/L的EGTA及2%双抗，pH为7.6；所述的灌流液B配方为15mmol/L HEPES，127.8mmol/L NaCl，3mmol/L KCl，0.7mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mmol/L CaCl₂，并添加有2%双抗，pH为7.6；步骤2：将肝脏转移到无菌的烧杯里，把烧杯浸泡在37℃‑38℃恒温水浴锅中，用80mL37℃预热的灌流液C循环灌注消化20分钟‑25分钟；所述的灌流液C的配方为：0.05g/L胶原酶，15mmol/L HEPES，127.8mmol/L NaCl，3mmol/L KCl，0.7mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mmol/L CaCl₂，pH为7.4；步骤3：将消化完毕的肝脏使用含2%双抗的D‑Hanks溶液洗脱肝细胞，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到肝细胞；步骤4：将分离得到的肝细胞使用无血清培养液稀释，并接入细胞板或细胞瓶培养；所述的无血清培养液配方为：基础培养液，0.5 mg/L地塞米松，5 mg/L转铁蛋白，0.5 mg/L牛胰岛素，10μg/L亚硒酸钠，20μg/L肝细胞生长因子，1%的双抗，其中，所述的基础培养液选自Williams' medium E基础培养液、DMEM基础培养液、L‑15基础培养液或1640基础培养液；其中，所述的双抗为青霉素和链霉素。2.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的步骤1中灌注灌流液A的速度为30mL/min，灌注灌流液B的速度为50mL/min，所述的步骤2中循环灌注灌流液C的速度为20mL/min。3.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的无血清培养液配方中的基础培养液为Williams' medium E基础培养液。4.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的灌流液C配方中的胶原酶为 IV型胶原酶或II型胶原酶。5.根据权利要求4所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的灌流液C配方中的胶原酶为 IV型胶原酶。