铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法

摘要

本发明公开了一种铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法，包括：铁碳纳米粒的制备，铁碳纳米粒搭载顺铂，铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表达的影响。本发明首次采用磁性纳米材料搭载顺铂，提供具有较强磁性及靶向性的化疗药物，应用于临床后，能够提高喉癌术前化疗效果，为功能性喉癌根治提供必要的、高效的化疗药物，同时能够应用于术后化疗，减少化疗药物的毒副作用，铁碳纳米材料良好的载药量、稳定的释放率及较强的靶向性也预示其能够在喉癌的临床推广应用后发挥重要的作用。

主权项

一种铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法，其特征在于，该铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法实现铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep‑2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3mRNA表达的影响，具体包括：步骤一，喉癌Hep‑2细胞培养及传代：细胞实验室进行消毒，紫外照射40min，佩戴护目镜及防冻手套，从液氮保存罐中取出出冻存管，放入4℃无菌蒸馏水中水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化后置入4℃10％二甲基亚砜；应用移液器将细胞悬液移入15ml离心管，加入10ml培养液，离心机1000r/min离心5min，分离喉癌细胞，0.25％胰蛋白酶恒温水浴箱预热20min，保持37℃，培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，培养于含100ml/L胎牛血清、青霉素及链霉素各100u/L的1640培养液中，37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱传代培养，次日更换培养液；记录复苏日期，观察细胞生长情况；步骤二，培养喉癌细胞分为药物组、微粒药物组、空白组和空白微球组，各组加入处理液；药物组的处理液为顺铂0.9％生理盐水溶液，微粒药物组为铁碳纳米粒顺铂0.9％生理盐水分散液，空白组是0.9％生理盐水，空白微球组是铁碳纳米微粒0.9％生理盐水分散液；步骤三，喉癌细胞生长抑制率检测：细胞传代至10‑16代，选取对数生长期的喉癌Hep‑2细胞，制成细胞浓度为4×10³/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml，37℃、5％CO₂培养，培养24h待细胞贴壁、进入对数生长期后，用无血清的RPMI‑1640培养液清洗两次，换液；每孔加入90μml培养液和100μml处理液；药物组及微粒组最终浓度梯度为10、20、40、80、160mg/L，每亚组设5个平行孔；37℃、饱和湿度、5％CO₂孵箱培养，24、48、72h后，吸除各孔原液，每孔加入100μlMTT液和900μl培养液，继续37℃、饱和湿度、5％CO2培养4h，吸除各孔原液900μl，每孔加入900μl二甲基亚矾，振荡混匀30min，自动酶标读数仪测定570nm各孔A值；抑制率(fa)＝(1‑实验组平均A值/空白组平均A值)×100％；步骤四，铁碳纳米粒顺铂抑制喉癌细胞形态学观察：将各组培养细胞浓度调整为透射电镜观察细胞在加药后的内在结构变化；扫描电镜观察细胞在加药后的表面形态变化及内部结构变化，重点在细胞膜形态及细胞核形态；步骤五，铁碳纳米粒顺铂对喉癌细胞caspase3mRNA、Survivin mRNA表达影响，具体包括以下步骤：第一步，总RNA提取：取各组细胞培养液加入1.5mlEP管中，加入Trizol 1ml，使细胞浓度为1×10⁷/ml/Trizol，用玻璃棒研磨，充分振荡混匀，加入氯仿0.2ml，盖紧盖子，轻轻摇动15s，15‑30℃孵育2‑3min，低温离心机4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mL Eppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，15‑30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心10min，弃去上清液，保留总RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75％乙醇1.0ml洗涤洗涤三次，1ml75％乙醇/ml Trizol，4℃7500r/min离心5min，弃去上清液，沉淀真空干燥5‑10min，保持适当湿度，以增加溶解度，加DEPC处理水溶解RNA，加入2.5倍体积75％乙醇，‑80℃保存备用；第二步，mRNA提取：总RNA标本解融后，取上述提取的总RNA到无RNase的EP管中，用无RNase的水定容到250ul，使RNA处于过饱和状态，加入Buffer OBB 250ul，Oligotex Suspension 15ul，用手弹匀，70℃水浴3分钟，RNA退火，裂解RNA二级结构，室温条件下，静置10分钟，4℃12000r/min离心2分钟，小心吸走上清，A液，用Buffer OW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后加到套有1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟后将SPIN柱子移到EP管上，加Buffer OW2400ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液；将SPIN柱子移到EP管上，加20‑100u1热的70℃，Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3‑4次，高速离心1分钟后转入无RNase的EP管中，加入等体积异丙醇，4℃12000r/min离心2分钟，弃去上清，沉淀加入75％乙醇，室温干燥，融于250ul无RNase的EP管中，备用；第三步，mRNA引物合成：在GenBank上查找目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0软件在CDS区设计特异性引物，采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成引物，序列如下：Survivin序列，扩增片段AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，长度129bp；Forward primer：5’‑AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT‑3’Reverse primer：5’‑GAC AAC TGC GTC TCTG‑3Caspase3序列，扩增片段，长度101bp；Forward Primer：5’‑AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA‑3’Reverse Primer：5’‑TGG CGC AAA GTG ACT GGA T‑3’第四步，逆转录：取4μlRNA模板做逆转录反应，仪器为ABI 9700仪，反应体系[5×逆转录buffer 4μl，下游引物0.4μl，dNTPs0.5μl，MMLV 1μl，DEPC水10.1μl，RNA模板；4μl，总体积20μl，逆转录buffer成分，50mM Tris‑HCl pH8.0，50mM KCl，4mM MgCl₂，10mM DTT；第五步，荧光定量PCR反应：采用标准曲线定量法制备阳性标准品，PCR扩增的阳性产物经过2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，含溴乙啶，用TAE缓冲液配制，在长波紫外下，割下目的条带；用回收试剂盒回收纯化；测定OD值检验纯度，OD 260/280＞1.8，用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度，即为阳性标准品；取阳性标准品5μl按10倍稀释，加水45μl并充分混匀，依次倍比梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度；然后待测样本和阳性标准品PCR反应，反应条件93℃3分钟，然后93℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共40循环；反应体系[5×SYBR Green I PCR buffer10μl，上游引物F1μl下游引物R1μl，dNTPs1μl，Taq酶1μl，cDNA5μl，ddH₂O 31μl，总体积50μl，PCR buffer成分：10mM Tris‑HCl，50mM KCl，2mM MgCl2；第六步，标准曲线的制备：标准品以去离子水依次稀释为4×10²，4×10³，4×104，4×10⁵，4×10⁶；每次扩增均使用标准品制备标准曲线，范围为每毫升10²‑10⁶；拷贝；第七步，PCR产物定量的校正和判定分析：采用GAPDH作为内参照，Survivin mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数；用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA精确含量＝目的基因CT值/内参照GAPDH CT值；以此比值做统计处理；根据FQ‑PCR原理，被激发的荧光信号达到阈值后被荧光探头采集，最后转换成CT值，该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比，即CT值越低，实际拷贝数含量越高。