修剪式多位点组合装配

摘要

本发明提供通过修剪式多位点组合装配产生多个修饰的多核苷酸的新方法，所述修饰的多核苷酸在多个位点具有各种突变的不同组合，该方法包括在单一反应混合物中将至少两种或至少三种引物添加至双链模板多核苷酸，其中所述引物不重叠，并且其中所述引物的每一种包括至少一个不同于其他引物的突变，其中至少一种引物是可退火至所述模板的负链的正向引物以及至少一种引物是可退火至所述模板的正链的反向引物，并使所述反应混合物进行聚合酶延伸反应以从所述至少三种引物产生多个延伸的修饰的多核苷酸。该方法可在将延伸的修饰的多核苷酸转化至细胞之前在不使用连接步骤的情况下进行。所述多个延伸的修饰的多核苷酸可用酶处理，以在转化至细胞之前破坏模板多核苷酸。

主权项

一种产生多个突变的多核苷酸的方法，其包括：(a)获得模板多核苷酸的序列信息，并鉴定在所述模板多核苷酸上的三个或更多个感兴趣的突变；(b)在单一反应混合物中将至少三种引物添加至双链模板多核苷酸，其中所述至少三种引物不重叠，并且其中所述至少三种引物的每一种包括至少一个不同于其他引物的突变，其中至少一种引物是可与所述模板的负链退火的正向引物以及至少一种引物是可与所述模板的正链退火的反向引物，和(c)使所述反应混合物进行聚合酶延伸反应以从所述至少三种引物产生多个延伸的突变的多核苷酸，其中在步骤(c)之前进一步包括：根据它们在所述模板多核苷酸上的位置，将所述引物编成多个组，其中覆盖所述模板上的相同选择区域的引物在一个组中，将每组中分入的引物归一化至相等的浓度，将一组中的所述正向引物富集成正向组并将每一正向引物组之间的浓度归一化至相等，将一组中的所述反向引物富集成反向组并将每一反向引物组之间的浓度归一化至相等，和将相等量的所富集的正向和反向引物添加至所述反应。