一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法

摘要

本发明提供的一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法，将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，体外成熟、体外受精后用含有200nMol/L组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)培养液培养10h，用不含有TSA的培养液继续培养，培养48h后统计卵裂率，培养7d后统计囊胚率即可，另将染色分离获取的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24h直接利用。该法对绵羊卵母细胞体外利用，具有重要的实用价值。

主权项

一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法，其特征在于：分步实施;步骤1将染色分离获取的质次BCB‑卵母细胞，用成熟培养液洗涤2‑3次，按25‑30枚/滴，放入前2h平衡好的体积为55‑78μl/滴的成熟培养液中，放入CO₂箱，在5% CO₂、95%的空气条件下培养；步骤2将步骤1体外成熟23‑25h的卵母细胞取出，用0.1%的透明质酸酶处理30‑60s，经吹吸，脱去卵母细胞周围的卵丘细胞；用体外受精液洗涤2‑4次，按25‑30枚/滴的密度加入前2h平衡好的50‑70μl的体外受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2h平衡好的装有体外受精液的试管，放入CO₂箱，上游20‑25min，取上清，在1500rpm条件下，离心4‑5min，弃去上清液，将剩余的精子沉淀，按2‑4×10⁶个/ml的密度加入体外受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；步骤3将步骤2受精20‑23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的体外培养液内，经吹吸，脱去卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3‑4次，按50‑70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h,再用不含TSA的体外培养液洗涤2‑3次，放置于不含TSA的体外培养液内培养7d，统计囊胚率；其中BCB‑卵母细胞的获取：摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，置入温度在30‑35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3h内用生理盐水清洗3‑4次，用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2‑8mm的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35‑60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25‑30μMol/L的BCB染色液，置于35‑39℃水浴中染色80‑90min，在显微镜下将BCB+和BCB‑卵母细胞分离，其中将染色分离的BCB+卵母细胞，用成熟培养液洗涤2‑3次，培养至24h，直接利用；步骤4实验液体的配制：抽卵液：TCM199hepes+1mg/ml PVA+0.7 mg／ml肝素钠；亮甲酚蓝染色液：PBS+26μMol/L亮甲酚蓝+ 5mg/ml BSA；成熟培养液：TCM199HCO₃+10%FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L 半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；SOF：6.29mg/ml NaCL +0.534 mg/ml KCL+0.162 mg/ml KH₂PO₄+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO₄+2.1mg/mlNaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O；体外受精液：SOF+20%FBS +6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素；体外培养液：SOF+3mg/mlBSA；含TSA体外培养液：SOF+200nMol/L TSA+ 3mg/mlBSA。