兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒

摘要

本发明公开了一种兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒。基于建兰转录组信息开发SSR引物，对这些标记进行了通用性和多态性分析，得到了49个兰属多态性标记，这些标记多态性高、重复性好，非常适用于兰属植物的遗传学研究。另外，根据标记在兰属物种中的分辨能力构建了核心指纹标记库。获得的SSR指纹标记库不但标记稳定可靠，而且具有数量较少、物种分辨能力强的特点，能最大限度反映兰属物种间差异（不是种内差异）且便于统计，可用于兰属主要物种的鉴定。

主权项

一种兰属微卫星标记的建立方法，其特征在于，步骤是：1)、建兰转录组序列的获得:选取建兰的花苞，提取总RNA，得到转录组序列片段（Reads），去除干扰信息后，完成序列拼接，获得建兰的转录组非冗余序列（Unigene）； 2)、建兰转录组非冗余序列中微卫星标记（SSR）位点的鉴定:采用SSR检索软件对Unigene进行SSR位点查找，从而获得一系列SSR位点，同时，分析Unigene的开放阅读框，然后根据这些开放阅读框来进一步确认SSR的位置；3)、建兰SSR引物的设计:选取进化选择压力小的SSR位点，进行引物设计，从而获得一系列SSR引物；4)、建兰SSR引物的扩增与筛选:利用步骤3）得到的建兰SSR引物对多个建兰品种的基因组进行PCR扩增；供试样的基因组采取CTAB法进行提取，然后PCR扩增，最后制备聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，恒压电泳直至指示剂到达底部，对凝胶进行银染显影，并用扫描仪器进行拍照、记录结果，最后用DNA ladder估算扩增产物的分子量；5）建兰SSR引物通用性检测：检验建兰中成功扩增的SSR引物的转移性（通用性），以其他兰属植物的基因组为模板，检测所述引物在其他兰属植物中的扩增情况，根据扩增结果，筛选多态的SSR引物。