一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法

摘要

一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，它涉及一种基因突变的电化学检测方法。本发明是要解决现有方法在检测细胞株基因突变时仅能通过检测遗传学终点来确定结果，手段繁复、费用高、误差大，且会对试验人员健康造成伤害的问题。本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法步骤如下：一：制备纳米复合工作电极；二：使用上述制备的纳米复合工作电极分别检测细胞裂解液、嘌呤碱基单体、嘌呤碱基混合液的电化学信号，分析并确定嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；三：用致突变剂使细胞发生突变后，每12h进行电化学检测，以不同时间电化学信号变化为指标，建立HGPRT基因突变电化学试验方法。本发明用于电化学检测方法领域。

主权项

一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于它是按以下步骤进行： 步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20‑30 min，直至形成均匀的电极修饰液，按0.01‑0.07uL/mm²的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:(15μL‑25μL)； 步骤二：按4.5×l0⁴‑5.5×l0⁴个/cm²的接种量将中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵巢CHO细胞为模型细胞系接种于含0.2‑0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5％培养箱中培养48h‑50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH＝7.0‑7.4的PBS缓冲溶液漂洗；然后每个培养皿中按21‑24μL/cm²的加入量加入pH＝7.0‑7.4的PBS缓冲溶液，在45‑55℃水浴中原位裂解细胞25‑35 min，获得细胞裂解液； 步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH＝7.2、扫描速度100 mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌呤碱基单体溶液浓度为5×10^‑6‑9×10^‑6M，溶剂为pH＝7.0‑7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH＝7.0‑7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为5×10^‑6‑9×10^‑6M； 步骤四：按4.5×l0⁴‑5.5×l0⁴个/cm²的接种量将中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵巢CHO细胞为模型细胞系接种于含0.2‑0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5％培养箱中培养24‑26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.06％的致突变剂为ENU或EMS的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1‑3h，做为加药组；另一组用含有0.1％DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1‑3h，做为阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养液的加入量均为0.2‑0.25mL/cm²； 步骤五：将步骤四的两组培养的细胞用缓冲液分别冲洗2‑3次，然后加入DMEM完全培养液培养，放于37℃、CO₂体积百分含量为5％的培养箱中培养7‑9天，每12 h或24h进行电化学检测，然后以电化学检测时间为横坐标，以在步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位对应的电压下所测得的基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因 突变的电化学检测方法；其中，DMEM细胞完全培养液加入量为0.2‑0.25mL/cm²。