葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒的内容物包括有：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准溶液，包被溶液、封闭溶液、洗涤液、化学发光液，以及化学发光酶联板，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，适合于疾病监控及快速定量检测食品及血液中金黄色葡萄球菌肠毒素C。

主权项

一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物包括：1)化学发光酶联板，该化学发光酶联板的各孔包被有抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体；2)辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，是由辣根过氧化酶标记的小鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体；使用时用封闭溶液配制成1:16000的工作浓度；3)金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准品溶液，该金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准品溶液的浓度分别为3.125pg/mL、6.25pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL和400pg/mL；4)包被溶液、封闭溶液、洗涤液和化学发光液；其中：所述包被溶液是1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L去离子水中的混合液，pH为9.5；所述封闭溶液是每升溶液中含体积分数为0.05的小牛血清、pH7.50.1mol/L的磷酸盐缓冲液；所述洗涤溶液是含有体积分数0.05吐温‑20，pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；所述化学发光溶液选择Pierce公司生产的ELISA超级发光液，A液与B液体积比为1:1的混合液；所述各孔包被有抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体为FMU‑SEC4单克隆抗体，所述化学发光酶联免疫板的各孔包被的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体的浓度为2.5μg/mL；所述辣根过氧化酶标记的小鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体为FMU‑SEC8单克隆抗体；所述FMU‑SEC4单克隆抗体与FMU‑SEC8单克隆抗体的制备和筛选方法如下：(1)采用8周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，以金黄色葡萄球菌肠毒素C为免疫原，首次免疫剂量为50μg/mL，将免疫原溶于生理盐水和等体积福氏完全佐剂制成乳化剂，皮下多点注射；间隔3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次免疫，佐剂为福氏不完全佐剂；2～3周后进行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔免疫，腹腔注射7～10天后尾静脉采血测其效价，如小鼠血清效价达到要求加强免疫一次，剂量同上，不加佐剂；加强免疫3天后取脾制备成单个细胞悬液，采用常规杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选及克隆化，共得到26株抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，分别命名为FMU‑SEC1～FMU‑SEC26；(2)将得到的一组抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，逐一常规标记辣根过氧化物酶，分别将该组中未标记的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液稀释至2.5μg/mL，将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心ELISA两两配对方阵法确定最佳抗体配对；配对抗体的挑选方法是：选择检测相同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素C的光吸收值最高，且检测无检测抗原或无关抗原的光吸收值最低的配对抗体，具体步骤为：A.96孔酶联板分别包被26株金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，4℃孵育过夜。B.洗涤液充分洗板3次，分别加入用封闭溶液稀释的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，浓度为浓度为0.01ng/mL，只加封闭溶液的孔设为空白对照孔，37℃孵育1h；C.洗涤液充分洗板3次，按照方阵法排列分别加入26株辣根过氧化物酶标记的检测抗体，100μl/孔，形成26×26方阵，37℃孵育1h；D.洗涤液充分洗板后，加入2，2’‑连氮基‑双(3‑乙基苯并噻吡咯啉‑磺酸)底物显色液，100μl/孔，37℃孵育15min，用酶标仪检测405nm下的吸光度(OD)值；经过抗体的配对筛选后，得到FMU‑SEC4单克隆抗体和FMU‑SEC8单克隆抗体。