一种多片段DNA分子组装方法及应用

摘要

本发明公开了一种多片段DNA分子组装方法，该方法包括以下步骤：载体系统构建、目标序列Lm和Rn克隆进入供给载体B1和/或供给载体B2、接受载体A1与供给载体B1和/或供给载体B2进行多片段组装等。本发明还公开了该方法在基因合成方面、大片段DNA克隆和多基因载体构建中的应用。本发明可以实现多片段DNA的无缝连接，形成一个长的DNA片段，不仅大大降低了大片段基因合成中易出现的突变问题，而且大大缩短了合成时间；在大片段DNA克隆方面，避免了长片段一次性克隆易产生突变，通过多个小片段克隆测序，然后进行组装。在多基因载体构建方面，实现了多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术。

主权项

一种多片段DNA分子组装方法，其特征在于包括以下步骤：1)载体系统构建：该系统包括由接受载体A1、供给载体B1和供给载体B2组成的系统，所述接受载体A1的多克隆位点中含有一组内切酶识别位点，且按照：“载体骨架‑‑‑反向奇数位内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑‑正向奇数位内切酶识别位点‑‑‑‑载体骨架”排列，且载体骨架中不含有此内切酶的识别位点；所述供给载体B1的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列L_m的顺序排列：“载体骨架‑‑‑正向奇数位内切酶识别位点‑‑反向克隆内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑正向克隆内切酶识别位点‑‑反向偶数位内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑‑正向偶数位内切酶识别位点‑‑‑反向奇数位内切酶识别位点‑‑‑载体骨架”排列，且此供给载体B1的载体骨架中含有的克隆内切酶识别位点被全部剔除，其中m＝1，3，5，7……等奇数；所述供给载体B2的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列L_n的顺序排列：“载体骨架‑‑‑正向偶数位内切酶识别位点‑‑反向克隆内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑正向克隆内切酶识别位点‑‑反向奇数位内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑‑正向奇数位内切酶识别位点‑‑‑反向偶数位内切酶识别位点‑‑‑载体骨架”排列，且此供给载体B2的载体骨架中不含有克隆内切酶识别位点，其中n＝2，4，6，8……等偶数；2)目标序列L_m克隆进入供给载体B1：先将目标序列L_m通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B1的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列L_m克隆进入供给载体B1，将供给载体B1上的“‑‑‑反向克隆内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑正向克隆内切酶识别位点‑‑‑”替代下来，得到载体B1‑L_m；目标序列L_n克隆进入供给载体B2：分别先将目标序列L_n通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B2的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列L_n克隆进入供给载体B2，将供给载体B2上的“‑‑‑反向克隆内切酶识别位点‑‑‑任意碱基‑‑‑正向克隆内切酶识别位点‑‑‑”替代下来，得到载体B2‑L_n，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数；3)多片段组装：a、将接受载体A1与载体B1‑L₁进行酶切连接反应，载体B1‑L₁上的目标序列L₁将被转移到接受载体A1上，得到载体A1‑L₁；b、将载体A1‑L₁和载体B2‑L₂用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1‑L₁和L₂连接得到载体A1‑L₁‑L₂；c、将载体A1‑L₁‑L₂和载体B1‑L₃用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1‑L₁‑L₂和L₃连接得到载体A1‑L₁‑L₂‑L₃；d、如此往复，直到完成得到载体A1‑L₁‑L₂‑L₃‑L₄‑L₅……‑L_m‑L_n大片段的组装，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数；其中，所述内切酶为BsmBI、BsaI、SapI或BbsI中的一种或几种。