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一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，其特征在于，步骤如下：(1)将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含体积百分数为2％的胎牛血清的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；(2)把样品组织置于5ml冰冷的含体积百分数为8％的胎牛血清的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加体积百分数为8％胎牛血清的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；(3)向步骤(2)制得的分散细胞补加10ml体积百分数为8％的胎牛血清的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含体积百分数为20％的牛血清白蛋白的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；(4)将步骤(3)制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；(5)将步骤(4)制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；(6)将步骤(5)制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用重量百分数0.01％的胰酶或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可；所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟；所述分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：1ml青霉素‑链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素；所述步骤(2)中生物酶消化按如下步骤操作：将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟；所述步骤(3)中的第一次离心为在4℃，600g离心8分钟；第二次离心为在4℃，1000g离心20分钟；所述步骤(4)中的经生物酶消化按如下步骤操作：1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃、100rpm的条件下水浴摇床中消化90分钟；所述步骤(5)中的第三次离心为在4℃，600g离心5分钟；所述步骤(6)中的内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：20ml血浆来源的血清，100μl青霉素‑链霉素溶液，1.0ml L‑谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，100‑150μl血管内皮生长因子，100‑150μl胰岛素样生长因子‑1，100‑150μl内皮生子因子。 |
