一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法

摘要

本发明属于转基因领域，涉及一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法。一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法，将小鼠附睾精子于5％CO2培养箱37℃孵育8～10分钟，然后将含有目的基因的线性DNA片段与精子混合，2℃～5℃冰浴25～30分钟，40～45℃热休克1～3分钟，2℃～5℃冰浴3～5分钟，5％CO2培养箱37℃孵育50～70分钟获能。该方法能够提高精子膜的通透性，便于基因片段进入精子内部，提高转基因效率。解决了以精子为载体制备转基因小鼠效率低、稳定性差、传代困难的问题。将为转基因小鼠制备提供一种有效的方法。

主权项

一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法，其特征在于将小鼠附睾精子于5%CO2培养箱37℃孵育8~10分钟，然后将含有目的基因的线性DNA片段与精子混合，2℃~5℃冰浴25~30分钟，40~45℃热休克1~3分钟，2℃~5℃冰浴3~5分钟，5%CO2培养箱37℃孵育50~70分钟获能；所述的含有目的基因的线性DNA片段是将目的基因插入质粒pcDAN3.1（+）后得到重组表达载体pTH‑CB，重组表达载体pTH‑CB经Pvul、Smal 双酶切得到的包括特异性启动子、目的基因在内的线性DNA片段；所述的重组表达载体pTH‑CB是通过如下方法获得：克隆小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列和钙结合蛋白D‑28K基因cDNA序列，用BamH I、HindIII内切酶双酶切小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列和质粒pcDAN3.1（+），回收连接酶切序列，使得小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列替换pcDAN3.1（+）中的CMV启动子序列；在此基础上，用HindIII、NotI内切酶双酶切上述重组质粒和钙结合蛋白D‑28K基因cDNA序列，将钙结合蛋白D‑28K基因cDNA序列插入上述重组质粒的多克隆位点即得所述的重组表达载体pTH‑CB。