高效降解高分子量多环芳烃的细菌分离方法及其应用

摘要

本发明涉及高分子量多环芳烃类污染土壤的生物修复。具体提供了一种多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的方法及其应用，该方法利用PCR-DGGE技术，迅速确定土壤样品中污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度的控制（40-60%），持久保持高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤。

主权项

一种多环芳烃降解细菌复合体的使用方法： (1)分别配制细菌培养基I、微量金属液A和维生素复合溶液备用： 细菌培养基I：硫酸铵2.5g、硫酸亚铁0.28mg、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾1.36g、硫酸镁0.25g、氯化钙10.7mg、氯化钠0.5g、氯化铁0.004g、1.0mL微量金属液A、1mL维生素复合溶液、加水至1000mL并将pH控制在7.2‑7.4，摇匀后作为液体培养基备用，若为固体培养基，则加入1.5％琼脂粉； 微量金属液A：CoCl₂·6H₂0 35mg、CuCl₂0.20mg、H₃BO₃6.0mg、MnCl₂·4H₂O 25mg、Na₂MoO₄·2H₂O 3.0mg、NiCl₂·2H₂O 2.0mg、ZnCl₂2.5mg，加水至1000mL； 维生素复合溶液：维生素B6 1.0mg、维生素C 1.5mg，加水至1000mL； (2)、细菌复合体的培养： 将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、微杆菌(Microbacterium sp.)利用培养基接种，室温90rpm条件下，摇床培养24‑48小时得到5×10⁸～5×10¹⁰CFU/ml浓度的细菌复合体液；培养基组成：每20L细菌培养基I添加10g‑20g葡萄糖、乙酸钠3‑15g； (3)、细菌复合体的投加： 将上述细菌复合体投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，投加菌的量为10ml/100g土壤，通过定期投加细菌培 养基I和微量金属液A和搅拌，保持土壤环境中的湿度在40‑60％之间，持久保持高效降解菌群的优势，每间隔10天，定期检测土壤中污染物浓度的变化，实验周期为60天； 细菌复合体的分离方法包括如下步骤： (1)在100ml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，10g新鲜高浓度PAHs污染土壤，25‑30℃，90rpm条件下培养； (2)在两个新的灭菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为200mg/L，苯并芘终浓度为10mg/L，接入1％体积含量的上述1中培养的细菌，25‑30℃，90rpm条件下避光摇床培养10天，重复操作步骤2至步骤1细菌富集培养液对芘和苯并芘降解速率达到稳定为止，得菌悬液A和B； (3)分别步骤2中获得的菌悬液A和B各取1ml培养液均匀涂布于10mg/L苯并芘[a]和200mg/L芘的细菌培养基I和1％葡萄糖的细菌培养基I上； (4)30℃，培养2‑4天，至菌落出现，从平板上挑取特征不同、生长旺盛且稳定的菌落，在含1％葡萄糖和1％乙酸钠的细菌培养基I固体平板上反复划线分离以获得纯菌种，16s rRNA鉴定； (5)取菌悬液A和B各1ml，5000rpm转速下，离心3分钟，倒掉上清液，再加入500ul灭菌蒸馏水，混悬，5000rpm转速下离心3分钟，倒掉上清液，加入200ul灭菌蒸馏水，100℃煮沸5分钟，冷却，10000rpm转速下离心5分钟，取上清液作为下一步16s rRNA V3 区扩增的模板； (6)分别以上述1和2步骤获取的菌悬液煮沸液为模板，进行V3区PCR扩增，将获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析； (7)将步骤6中得到的含芘和苯并芘[a]不同样品的变性梯度凝胶的条带比对，以两个样品中都含有的条带和各自优势的条带作为目的片断进行回收、纯化及测序，将所得的序列片断在GenBank数据库进行同源性分析和检测； (8)综合上述步骤4和步骤7的结果，优化菌群，确定该污染土壤中主要优势降解菌株； (9)通过上述过程，筛选得到的菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、微杆菌(Microbacterium sp.)。