肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用

摘要

本发明提供肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，以及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。本发明提供了肝素酶II在解聚肝素前体中的新用途，提供了一种肝素酶法制备LMWH的新途径，该方法反应条件温和，产品和酶易于分离，生产方便，具有重大应用前景。

主权项

一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法，所述方法包括：(1)从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段(Genbank access number U27585.1)，克隆到pET‑15b表达载体中，获得重组载体pET15b‑hepB，pET15b‑hepB转化E.coli BL21(DE3)获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET15b‑hepB，重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶II；(2)Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25℃下反应1.5h，反应液经分离纯化，得到解聚后的Heparosan；所述缓冲液组成为：乙酸钠100mM，BSA0.01％，乙酸钙10mM，溶剂为水，pH7.0；缓冲液中Heparosan初始浓度为0.01～0.1g/mL，重组肝素酶II初始添加量为100～500U/mL；(3)解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化，制得所述低分子量肝素。