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高通量微流控芯片检测系统的构建方法，其特征是依次包括以下步骤：第一步、基于μParafloTM微流体生物芯片原位合成6种不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连；6种探针的序列如下：A：3'CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T5'；B：3'CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA5'；C：3'TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A5'；D：3'TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG5'；E：3'AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C5'；F：3'TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T5'；第二步、合成针对6种转基因蛋白的抗体‑寡核苷酸链复合物探针；包括如下步骤：1)、准备6种转基因作物蛋白的抗体探针；2)、合成6种核酸序列；3)、对相应抗体和寡核苷酸链进行交联；包括如下步骤：A、抗体的修饰与脱盐：将6种抗体分别进行以下操作：取45～55μg抗体溶液，加入分子截留量为50kDa的超滤膜中，再加入280～320μL的pH7的修饰缓冲液，离心，至膜上留下的液体为19～21μL，然后用SANH溶液修饰，SANH与抗体之间的摩尔比为50～70：1；再放置于24～26℃的摇床中孵育修饰3～5小时；孵育完后将产物洗涤、离心，以除去多余的作为修饰剂的SANH，用pH6的交联缓冲液洗涤，使抗体被置换到交联缓冲液中，然后收集脱盐后的抗体修饰产物；B、核苷酸的修饰与脱盐：用pH7修饰缓冲液将核苷酸冻干粉配置至8～12mg/mL，然后用SFB溶液修饰；SFB与核苷酸之间的摩尔比为50～70：1；放置于24～26℃的摇床中，孵育修饰3～5小时；孵育完将产物洗涤、离心，以除去多余的SFB修饰剂，再用pH6交联缓冲液洗涤，使寡核苷酸被置换到交联缓冲液中，然后离心，收集脱盐后的核苷酸修饰产物；C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化：将修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物与修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物均匀混合，免疫球蛋白与核苷酸的摩尔比为1:8～12；于3～5℃下反应10～14小时；所得的交联后产物再次纯化，从而除去未交联的多余的核苷酸单体；D、抗体上残留基团的封闭：为了避免交联过程中抗体上经修饰但未与核酸进行交联的基团与芯片表面发生反应而产生非特异性结合，交联后进一步对交联体进行基团封闭；6种转基因作物蛋白的抗体探针为：(1)Bt Cry1Ac兔单抗；(2)Bt Cry1c兔多抗；(3)Bt Cry1Ab兔单抗；(4)Bt Cry1F兔多抗；(5)大豆胰蛋白酶抑制剂兔多抗；(6)新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因兔单抗；六种核酸的序列以及待与其交联的抗体种类如下：a：5'GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A3'，抗Cry1Ac兔单抗；b：5'GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT3'，抗Cry1c兔多抗；c：5'ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T3'，抗Cry1Ab兔单抗；d：5'ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC3'，抗Cry1F兔多抗；e：5'TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G3'，抗SBTI兔多抗；f：5'AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A3'，抗NPTⅡ兔单抗；第三步、抗体—核苷酸交联体与微流控芯片作用：1)、芯片循环系统的清洗：在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗；2)、芯片表面的封闭：将第一步中生成的芯片置入微流体杂交室中，取6×SSPE缓冲液接入循环体系，循环润洗芯片表面，赶尽芯片中气泡；再取封闭缓冲液移入样品管，流速80～120μL/分钟，28～32℃循环流经芯片25～35分钟；封闭缓冲液的制备方法：①准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8，②取75mL上述①所得的调节pH后的6×SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合；③准备BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中；④制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合；3)、探针在芯片表面的固定：将第二步制备的6种抗体‑寡核苷酸复合物探针以各45～55nM的浓度混合稀释在100μL的封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，28～32℃下流速15～25μL/分钟循环孵育1.5～2.5h；探针固定反应完成后，用洗涤缓冲液洗涤芯片表面，从而将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去；上述洗涤缓冲液的制备方法为：将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入1mg的SDS均匀混合；4)、完成以上步骤后，得合成的蛋白质芯片。 |
