油菜转基因检测试剂盒

摘要

本发明涉及检测用品领域内的一种油菜转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为11重双启动寡核苷酸引物组合，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的11组探针序列和一组阳性对照探针序列，各探针的5’端做氨基标志；引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志的Tag引物。本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的油菜转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。

主权项

一种油菜转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为11重双启动寡核苷酸引物组合，各对引物的碱基序列5’‑3’如下，其中碱基I为次黄嘌呤核苷酸：EPSPS：正向引物： CTTTCTGGAACCGTCCGTATIIIIIGTGACAA反向引物：CCAAGTATCACCTTCCTTACIIIIICTGGCAC；GOX：正向引物：CTGCTGCTCCTAACTGGAAGIIIIITCACGTT反向引物：GGTCATTGGAGCACCAGTCAIIIIIAGGTGAC；PAT：正向引物： TGAGACGTCTACAGTGAACTIIIIIACAGAGC反向引物：CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGIIIIICCAGCCA；NPTII：正向引物： CGAAGTGCCGGGGCAGGATCIIIIITCATCTC反向引物：CGCGAGCCCCTGATGCTCTTIIIIIAGATCAT；BAR：正向引物： GACGACCTCGTCCGTCTGCGIIIIIGCTATCC反向引物：CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC；BARNASE：正向引物： ATTATCGTGGATTTCCGTTTIIIIICTGGTGC反向引物：GCTTATGATATGTCTGAAGAIIIIICGCAACC；BARSTAR：正向引物： CCTGGACGCTTTATGGGATTIIIIIACCGGAT反向引物：TTCCGCTTTCGCTTCACGGAIIIIITGAAGCA；FMV35S：正向引物： GGAAGAATTCTCAGTCCAAAIIIIIAACAAGG反向引物： CAAAGATGCCCACTAACTTTIIIIITTCGGTG；CaMV35S：正向引物：GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC反向引物：TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA；NOS 3’：正向引物： TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT反向引物：CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT；PEP：正向引物： ATACGCTACAACTACCAATAIIIIICGAGTGG反向引物：GGAAAAAAGGTCGAGAAGTTIIIIICACGAGG；膜芯片为顺序固定在支持膜表面的11组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，11组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’‑3’如下，各探针的5’端做氨基标志：EPSPS探针: NH₂‑5’‑TATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACACTGGTAAGGCTATGCAAGCTA‑3’；GOX探针: NH₂‑5’‑CCCTTCCAGTGATTGGTCGTGCTACCCGTACTCCAGACGTTATCTACGCTTTCGGTCAC‑3’；PAT探针: NH₂‑5’‑GGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAG‑3’；NPTII探针: NH₂‑5’‑CACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGA‑3’；BAR探针: NH₂‑5’‑CGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCG‑3’；BARNASE探针: NH₂‑5’‑AACGGAAACATCTTCTCACAAGGCACACACAGAAGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG‑3’；BARSTAR探针: NH₂‑5’‑CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACTGAAAATGGCGCCGAGA‑3’；FMV35S探针: NH₂‑5’‑CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT‑3’；CaMV35S探针: NH₂‑5’‑AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG‑3’；NOS 3’探针: NH₂‑5’‑ATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA‑3’；PEP探针: NH₂‑5’‑GAGATTTTTCCAAGGCTTCAAACTCTTTCATCACATGTCTCTTCTCTTTCCATTGTCTT‑3’；Positive探针: NH₂‑5’‑TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGTCAGGGAGAATCACTACGTACAAGC‑3’；所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志的Tag引物，其碱基顺序如下所示：Tag引物：biotin‑5’‑GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG‑3’。2.根据权利要求1所述的油菜转基因检测试剂盒，其特征在于所述油菜转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸、EX‑Taq聚合酶和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin‑5'‑ GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA‑3’。3.根据权利要求1所述的油菜转基因检测试剂盒，其特征在于所述油菜转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺显色液。4.根据权利要求3所述的油菜转基因检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液；杂交液为5×SSC，0.1% 重量百分比SDS，5×Denhardt’s，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml 酵母tRNA；洗液分别为洗液1：2×SSC和0.1% 重量百分比SDS，洗液2：0.5×SSC和0.1%重量百分比 SDS，洗液3：100 mM Tris‑HCl，pH7.5，150 mM NaCl，洗液4：100 mM Tris‑HCl，pH9.5，100 mM NaCl和100 mM MgCl₂；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mM Tris‑HCl，pH7.5，150 mM NaCl；四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液：200mM柠檬酸钠pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液： 3%重量百分比的H₂O₂用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。5.根据权利要求1所述的油菜转基因检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。