发明名称 |
一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法 |
摘要 |
本发明公开了一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法,包括以下步骤:(1)EST细胞单克隆化:无外源微生物污染的EST细胞,以CSFV C株感染,37℃5%CO<sub>2</sub>条件下培养48h后,经0.25%胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释,种于96孔细胞板,37℃5%CO<sub>2</sub>条件下培养,8小时后观察每孔,排除存在细胞团的培养孔,然后继续培养1周,挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔,将孔中细胞进行亚克隆筛选,连续以此方法亚克隆筛选3次后获得亚克隆细胞系。本发明简化传统细胞苗生产过程中的单次接毒程序,为猪瘟细胞苗的生产缩短周期和降低成本。 |
申请公布号 |
CN104099292A |
申请公布日期 |
2014.10.15 |
申请号 |
CN201410334023.6 |
申请日期 |
2014.07.11 |
申请人 |
陕西溯源农业发展有限公司 |
发明人 |
敬晓棋;孙世琪;郭慧琛;魏衍全;黄光东;张琼;陈生叶 |
分类号 |
C12N5/071(2010.01)I;C12N7/00(2006.01)I;C12R1/93(2006.01)N |
主分类号 |
C12N5/071(2010.01)I |
代理机构 |
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代理人 |
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主权项 |
一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)EST细胞单克隆化无外源微生物污染的EST细胞,以CSFV C株感染,37℃5%CO<sub>2</sub>条件下培养48h后,经0.25%胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释,种于96孔细胞板,37℃5%CO<sub>2</sub>条件下培养,8小时后观察每孔,排除存在细胞团的培养孔,然后继续培养1周,挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔,将孔中细胞进行亚克隆筛选,连续以此方法亚克隆筛选3次后获得亚克隆细胞系;(2)可高滴度繁殖猪瘟病毒C株细胞系的选育及鉴定将上述EST细胞各克隆细胞系分别接种于24孔细胞培养板内,37℃5%CO<sub>2</sub>条件下培养48h,弃去培养液,用PBS洗细胞2次,经0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞,利用RNAisoPlus试剂提取总RNA,经RT‑PCR后初步鉴定出持续感染有猪瘟病毒C株的细胞系;RT‑PCR鉴定CSFV C株的特异性引物:上游引物:TAACACGACTGTCAAGGTGC;下游引物:AACCATGAGCAATGCCACT;将初步鉴定持续带毒的EST细胞系于35mm的培养皿内,待细胞长满单层后,利用间接免疫荧光检测确定阳性细胞数,免疫荧光检测显示,几乎100%的细胞均带有CSFV抗原;将确定以高滴度猪瘟病毒C株持续感染的EST细胞系进行传代培养,分别在3,9,15代进行反复三次冻融收毒;病毒原液离心去除细胞碎片后,以DMEM液按10倍梯度稀释,将病毒稀释液接毒于铺满96孔板的PK15细胞,37℃,5%CO<sub>2</sub>培养箱培养48h后,用间接免疫荧光方法检测病毒感染细胞;按照Reed‑Muench方法计算病毒半数致死量TCID50,以3次重复实验结果的算术平均值为培养病毒的感染滴度;TCID<sub>50</sub>测定结果显示,细胞连续传代15代以上,其病毒低度维持在10<sup>5.5</sup>TCID<sub>50</sub>/mL,比单次接种EST母细胞后的病毒滴度高100倍。 |
地址 |
710000 陕西省西安市经济技术开发区海荣名城62号楼2单元1803房 |