一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞及其制备方法

摘要

本发明提供了一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞及其培养方法，培养方法包括以下步骤：1）将冻存的BHK-21细胞复苏并贴壁培养，得到贴壁培养的BHK-21细胞；2）贴壁培养的BHK-21细胞利用培养液传代培养得到悬浮培养的BHK-21细胞并冻存；3）悬浮培养的BHK-21细胞进行复苏培养并进行生物学特性鉴定；4）鉴定合格的悬浮培养的BHK-21细胞进行生物反应器适应培养。本发明的有益效果为：本发明提供的细胞驯化方法及得到的可悬浮培养的BHK-21细胞，节省了培养液和牛血清，将悬浮培养的细胞运用到实际生产中在场地和人力投入上也会大幅度节省，符合目前节能、环保及低碳理念，在带来可观地经济效益的同时，也会产生较好地社会效益。

主权项

一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK‑21细胞的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将冻存的BHK‑21细胞复苏并贴壁培养，得到贴壁培养的BHK‑21细胞；2）贴壁培养的BHK‑21细胞利用培养液传代培养得到悬浮培养的 BHK‑21细胞并冻存；3）悬浮培养的BHK‑21细胞进行复苏培养并进行生物学特性鉴定；4）鉴定合格的悬浮培养的BHK‑21细胞进行生物反应器适应培养；所述步骤1）中，细胞复苏的方法为，40℃水浴中快速解冻冻存的细胞，每支冻存管中细胞数量至少为3.0×10⁶个，并将解冻的细胞接种到含10%的牛血清的MEM培养液中，置37℃，5%CO₂培养箱培养2小时后以同样的含10%的牛血清的MEM培养液对之前的培养液进行替换，待细胞长成致密单层后，用0.25%胰酶消化并按照将1瓶分成3瓶的比例传代培养至致密单层，培养条件为37℃，5%CO₂；所述步骤2）中，BHK‑21细胞的驯化过程为：a）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12和MEM等体积的混合培养液传代培养两代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；b）用含体积百分含量8%牛血清的按体积比DMEM/F12：MEM为3:1的混合培养液传代培养三代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；c）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液传代培养三代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；d）用含体积百分含量5%牛血清和10%上清液的DMEM/F12培养液传代培养三代，所述上清液为步骤c中含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液细胞传代培养后的上清液，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；e）用含体积百分含量3%牛血清和5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；f）用含体积百分含量3%牛血清和2.5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；g）用含体积百分含量1%牛血清的DMEM/F12培养液和无血清培养基等体积混合培养液培养两代，培养条件为37℃，5%CO₂，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可，最后一代按质量比1：1.5传代培养24小时后置于2‑8℃静置48小时；h）将步骤g）中最终得到的细胞培养液取出，轻摇细胞瓶收集悬浮在培养液中细胞和贴附性不好的细胞，并用胰酶轻度消化后吸集剩余细胞，补加低血清培养液至40ml，所述低血清液中含1%牛血清，0.03%PF68，0.02%的细胞分散因子，CO₂环境摇床培养24小时，振荡速度为110r/min；i）将步骤h）最终得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清20ml, 剩余培养液移至另外的培养瓶中补加低血清培养液至40ml，所述低血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02%细胞分散因子；并重复一次上述操作；j）收集步骤i）中得到的细胞至250ml悬浮培养瓶, 补加无血清培养液体积至200ml, 搅拌过夜，130 r/min；k）将步骤j）得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清100ml, 剩余培养液移至另一烧瓶中，补加低血清培养液至40ml，所述低血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02%细胞分散因子；进行细胞计数，并进行冻存，每支冻存管至少含1.0×10⁷个细胞。