燕窝胶体金免疫试纸条及其制备方法

摘要

本发明提供一种燕窝胶体金免疫试纸条，包括样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC背衬，所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫粘附于所述样品垫之上，并与所述反应垫相搭接；所述反应垫与所述吸水垫相搭接；所述结合垫包被有抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物，所述反应垫分别包被有唾液酸糖蛋白抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。本发明可对燕窝及其相关产品进行定性检测，适用范围广，特异性好，抗基质干扰效果好，可实现燕窝及其相关产品的现场快速鉴别，检测成本低。

主权项

一种燕窝胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于：燕窝胶体金免疫试纸条包括样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC背衬，所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫粘附于所述样品垫之上，并与所述反应垫相搭接；所述反应垫与所述吸水垫相搭接；所述结合垫包被有抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物，所述反应垫分别包被有唾液酸糖蛋白抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线；所述检测带与所述质控带的距离为5mm~10mm，所述方法包括如下步骤：A）   燕窝唾液酸糖蛋白的分离和纯化：目标抗原为燕窝唾液酸糖蛋白，该蛋白由具有相同抗原决定簇但糖基化修饰程度不同的分子量分别为106kDa和128kDa的两个蛋白组成，等电点≤3.0，将燕窝经过7M尿素超声提取10min，离心取上清，使用液相等电聚焦仪进行分离纯化，目标蛋白在正极沉淀，经过去离子水洗涤后得到目标蛋白；B） 抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化：用燕窝唾液酸糖蛋白分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只，首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射，间隔两周后，取同样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射；在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒；用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI‑1640完全培养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃ CO₂培养箱中；小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI‑1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心；将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5：1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI‑1640不完全培养液20mL，混合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI‑1640完全培养液10mL，1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中孵育；融合后6~9d，用HAT培养液半量换液1次，在12~14d后根据增殖情况改用RPMI‑1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞； 采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产燕窝唾液酸糖蛋白抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆；无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2~1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2~5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存，提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔，取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数；将细胞腹腔注射小鼠腹部，10~15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装‑70℃冻存备用；取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液，将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33μg/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀，取上清经0.45 μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合，用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4，上清冷却到4℃，加硫酸铵至终浓度为0.277g/mL，搅拌30min，4℃下10000 r/min离心30min，弃上清，用少量PBS溶液溶解沉淀，用50~100倍体积的PBS透析过夜，换液3次，得到纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体，4℃下贮藏备用；C） 胶体金的制备；取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，调pH5.9～6.2，超纯水定容至100mL；D）    抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物的制备；在磁力搅拌下，将100μg/mL抗唾液酸糖蛋白抗体溶液10mL加入10mL pH5.9～6.2的胶体金溶液中，加入抗唾液酸糖蛋白抗体溶液时应逐滴加入，分别取1ml抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物和1ml胶体金原液于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验；E） 结合垫的制备；使用PBS溶液稀释抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物至工作浓度10μg/mL，均匀浸于玻璃纤维素膜，‑20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫，4℃密封保存；F）  反应垫的制备；取2mg/ml的燕窝唾液酸糖蛋白用0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液以250μg/ml间隔，经BIO‑DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测线，距离检测线5mm远的质控线用dispenser线形包被2mg/ml的正常羊抗鼠IgG，37℃干燥2h，得到反应垫，4℃密封保存；G）    样品垫的处理；将样品垫浸泡于含BSA的0.01mol/L PBS缓冲液中30min，37℃烘干，真空封装，4℃密封保存；其中，牛血清白蛋白的终浓度为2%质量百分比浓度；H）    燕窝胶体金免疫试纸条的组装；依次将样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫粘附于PVC背衬上，样品垫设置有样品孔，反应垫包被有检测线和质控线，结合垫粘附于样品垫之上，并与反应垫相搭接，反应垫与吸水垫相搭接，真空封装，4℃密封保存，可保质1年以上；所述反应垫采用硝酸纤维素膜；所述结合垫采用玻璃纤维素膜；所述样品垫设置有样品孔。