发明名称 |
人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及应用 |
摘要 |
本发明提供一种人类乳头瘤病毒HPV-8E7蛋白的表达纯化方法,通过设计HPV-8E7的扩增引物,并从HPV-8E7质粒中有效扩增出这个基因,插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中,获得重组载体,转染,收集上清与4B磁珠结合,再用凝血酶切除GST标签,获取HPV-8E7蛋白,行多点免疫,获得纯化的多克隆抗体。本发明增加了该蛋白原核表达时的可溶性,从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度,在提高表达量的同时也有利于分离纯化,使该蛋白在工业化放大生产时降低难度,减少成本,并经纯化、免疫,得到高特异性、高效价比的多克隆抗体,能大大提高检测的准确率,为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。 |
申请公布号 |
CN104059934A |
申请公布日期 |
2014.09.24 |
申请号 |
CN201410194991.1 |
申请日期 |
2014.05.11 |
申请人 |
浙江大学 |
发明人 |
程浩;陈贤祯;韩睿;朱可建;周强;丁杨 |
分类号 |
C12N15/70(2006.01)I;C07K16/08(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/70(2006.01)I |
代理机构 |
杭州求是专利事务所有限公司 33200 |
代理人 |
张法高;赵杭丽 |
主权项 |
人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及纯化方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1)<b><i>HPV‑8E7</i></b><b>基因的调取及扩增:</b>设计<i>HPV‑8E7</i>的扩增引物,并从HPV‑8E7质粒中有效扩增出这个基因,其中用于扩增用于原核表达的<i>HPV‑8E7</i>序列的上游引物序列SEQ ID NO.1:5’‑<u>GGATCC</u>ATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT‑3’,划线部分为<i>Eco</i>RⅠ酶切位点,下游引物序列SEQ ID NO.2:5’‑<u>GAATTC</u>TTATGATCCGCCATGTTTGCA‑3’,划线部分为<i>Bam</i>HⅠ酶切位点;用于扩增用于真核表达的<i>HPV‑8E7</i>序列的上游引物序列SEQ ID NO.3:5’‑ <u>GAATTC</u>TATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT‑3’, 划线部分为<i>Bam</i>HⅠ酶切位点,下游引物序列SEQ ID NO.4:5’‑<u>GGATCC</u>TTATGATCCGCCATGTTTGCA‑3’,划线部分为<i>Eco</i>RⅠ酶切位点;(2)<b><i>HPV‑8E7</i></b><b>基因原核及真核表达载体的构建:</b>将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV‑8E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中,获得用于后续同源重组的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑8E7)和pEGFP‑C1‑(HPV‑8E7);(3)<b>GST‑(HPV‑8E7)</b><b>融合蛋白的原核表达:</b>将步骤(2)中构建的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑8E7)转入大肠埃希菌DH5α,优化IPTG浓度、诱导时间和诱导温度;在250‑300w超声功率下,超声时间9秒,间歇时间9秒,总时长约3分钟以破碎细菌,收集上清;(4)<b>GST‑(HPV‑8E7)</b><b>融合蛋白的纯化及HPV‑8E7</b><b>蛋白的获得:</b>通过(3)步骤获得的上清与Glutathione‑Sepharose 4B磁珠结合,再用凝血酶切除GST标签,获取HPV‑8E7蛋白,PBS透析过夜获得纯化的HPV‑8E7蛋白。 |
地址 |
310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号 |