一种快速检测6种转基因玉米的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测6种转基因玉米的方法，该方法包括光学薄膜生物传感器芯片准备、转基因玉米的转化体特异性序列选择、探针合成及点阵、样品DNA提取及纯化、引物合成及生物素标记、PCR扩增、杂交、沉淀反应及显色观察的操作步骤。本发明检测方法的检测灵敏度和准确性高，样品中DNA浓度在0.01μM时便可检测出结果，准确率可达100.00％；检测通量大，适用于低、中、高不同通量的检测要求；检测速度快，所用时间短，只需30min便可检测出结果，比常规检测方法用时少10h以上；检测程序简单，检测结果可直接肉眼观察，免去了荧光标记和仪器扫描等常规检测的实验程序；检测成本低，极大地减少了试剂和设备投入。

主权项

一种快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于如下步骤：步骤一、光学薄膜生物传感器芯片准备；所述的光学薄膜生物传感器芯片为硅材质光学薄膜生物传感器芯片，芯片分为三层，从下到上依次为硅支持层、光反射层、表面附着层；步骤二、转基因玉米的转化体特异性序列选择，探针和引物设计；在6种转基因玉米品种DNA序列上的外源基因序列及插入位置上的DNA序列，以及所包含的基因序列上，在连接区域选取100～300bp长度的DNA片段，使该片段既包含部分转入的外源基因序列，又包含部分该玉米品种所特有的基因序列，即获得了该种转基因玉米品种的转化体特异性序列；所述的6中转基因玉米品种分别为Bt11、Event176、GA21、MON810、NK603、T25；所述的探针和引物的设计如下：注：F：正向序列引物；R：在5’端带有生物素标记的反向序列引物；P：在5’端带有20个dATP的序列，并进行了醛基修饰的探针；步骤三、探针合成及点阵； 根据步骤二中设计的探针序列，在探针5’端连接20个dATP，然后在5’端进行醛基修饰，用pH7.8的0.1M磷酸盐缓冲液稀释的探针浓度为1μM，用移液器或点样仪将探针点阵在芯片上；室温湿润环境下放置2h以上，用0.1×SDS轻轻清洗3遍，再用ddH₂O洗3遍，吹干备用；根据需要，在芯片上设计探针样点重复数，点样量为每点40～250nl；步骤四、样品DNA提取及纯化；用Tiangen核酸提取纯化试剂盒提取并纯化DNA；步骤五、引物合成及生物素标记；按步骤二中设计的引物序列，分别合成6种转基因玉米的正向和反向序列引物，其中反向序列引物在5’端进行生物素标记；步骤六、PCR扩增；用合成的正向序列引物和反向序列引物对提取的DNA进行PCR扩增，其PCR反应条件为25μl混合物，包括1×PCR Buffer，2mM MgCl，0.1mM dNTP，0.2μM引物，1U rTaq和100ng的DNA模板；反应在PTC‑225 Peltier Thermal Cycler中进行；扩增前先94℃变性5min；之后进行40个扩增循环，扩增循环程式设定为94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s；循环后72℃延伸10min；4℃保存；步骤七、杂交；取90μl HB加到芯片上，45℃温育5min；取2μl PCR产物与8μl ddH₂O混匀后，95℃变性3min；将变性后的PCR产物加于芯片上的HB缓冲液中，混匀，45℃孵育10min；室温下用0.1×SSC 100μl清洗芯片3次，吹干；步骤八、沉淀反应及显色观察检测结果；取100μl anti‑biotin‑HRP加到传感器芯片上，室温放置5min；室温下，用0.1×SSC100μl清洗芯片3次，吹干；取100μl TMB加到传感器芯片上，室温避光放置5min；用100μl ddH2O漂洗芯片3次，吹干；观察芯片表面探针颜色，获得检测结果。