一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法

摘要

一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法，涉及香蕉胚性悬浮细胞体系的建立方法。包括如下步骤：A、选用目前大面积推广的香蕉品种或者较难诱导出胚性愈伤的香蕉品种；B、选取开花后1到10周的香蕉花蕾，在正式培养未成熟雄花之前，这些花蕾可以保存24小时；C、胚性愈伤诱导；D、胚性悬浮细胞的获得；E、幼胚的发育；F、幼胚再生成幼苗。本发明通过在香蕉未成熟雄花胚性诱导和胚性悬浮细胞体系建立的不同关键阶段运用不同的培养基配方和培养工艺，达到提高香蕉未成熟雄花胚性诱导成功率和香蕉胚性悬浮细胞系建立的成功率，该发明的运用有效地建立了大面积推广的多个三倍体香蕉品种的胚性悬浮细胞系，利于香蕉不同品种转基因工作的开展。

主权项

一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤获得成功率的方法，其特征在于包括如下步骤：A.选用目前大面积推广的香蕉品种或者较难获得胚性悬浮细胞系的香蕉品种，包括：巴西蕉、威廉斯B6、海蕉一号、高种天宝蕉、高脚顿地雷、齐尾、河口高把香蕉、仙人蕉、矮脚顿地雷、广东香蕉2号；B.胚性愈伤的诱导1)选取开花后1到10周的香蕉花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到第20排的雄花出现为止；4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花，最接近分生组织突起的雄花为第1排，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4‑D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4‑D即2，4‑二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a‑萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；C.胚性悬浮细胞系的诱导：1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6m1液体培养基M2中；液体培养基M2为：MS+1mg/L2，4‑D+100mg/Lglutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/LAG，pH＝5.3；所述2，4‑D即2，4‑二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％‑20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％‑20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞；4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；D.植株再生1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加液体培养基M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6‑(2‑isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月；4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5.8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6‑苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1μmol/L IAA+1μmol/L BAP，pH＝5.8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6‑苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。