一种具有组织学结构的人工食道的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有组织学结构的人工食道的制备方法，特点是先从动物食道的粘膜组织中提取基膜蛋白液，然后制取电纺丝/脱细胞基质支架，再制取带有双面微槽的聚氨酯薄片，最后将聚氨酯薄片包裹在电纺丝/脱细胞基质支架外并纵向缝接成管状，得到具有组织学结构的人工食道；优点是通过该方法可制备出模拟正常人体食道的组织学结构的人工食道，利用了组织工程学原理，在体外构建出与人体食道具有相似微观构造和功能的人工食道，然后逐层与病变食道切除后的剩余食道相缝接，使人工食道逐渐长成为真正的食道，并与人体内原有食道融合，与传统的替代物相比，结构与功能上更趋近天然食道，能减轻病患的痛苦，延长病患的生命。

主权项

一种具有组织学结构的人工食道的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）、取动物食道中的粘膜及粘膜下层，洗净、剪碎，并将粘膜及粘膜下层组织浸入由NaCl、Tris‑HCl、苯甲基磺酰氟和N‑甲基马来酰亚胺混合而成的溶液中，其中：NaCl在溶液中的浓度为3.4mol/L、Tris‑HCl在溶液中的浓度为0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的浓度为2mmol/L、N‑甲基马来酰亚胺在溶液中的浓度为1mmol/L，匀浆后将匀浆液在４℃的低温下以8000～12000r/min的转速离心20min，取离心后的上清液，并将离心后剩下的沉淀物再浸入由NaCl、Tris‑HCl、苯甲基磺酰氟和N‑甲基马来酰亚胺混合而成的溶液中，其中：NaCl在溶液中的浓度为0.5mol/L、Tris‑HCl在溶液中的浓度为0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的浓度为2mmol/L、N‑甲基马来酰亚胺在溶液中的浓度为1mmol/L，匀浆后将匀浆液在４℃的低温下以8000～12000r/min的转速离心20min，取离心后的上清液，并将离心后剩下的沉淀物接着浸入由盐酸胍、二硫苏糖醇和Tris‑HCl混合而成的溶液中，其中：盐酸胍在溶液中的浓度为2.0mol/L、二硫苏糖醇在溶液中的浓度为2mmol/L、Tris‑HCl在溶液中的浓度为0.05mol/L，匀浆后将匀浆液在４℃的低温下以8000～12000r/min的转速离心20min，取离心后的上清液，并将离心后剩下的沉淀物最后浸入由盐酸胍、二硫苏糖醇和Tris‑HCl混合而成的溶液中，其中：盐酸胍在溶液中的浓度为4.0mol/L、二硫苏糖醇在溶液中的浓度为2mmol/L、Tris‑HCl在溶液中的浓度为0.05mol/L，匀浆后将匀浆液在４℃的低温下以8000～12000r/min的转速离心20min，取离心后的上清液，将四次所取得的上清液混合，得到基膜蛋白液，用于支架包被；（2）、取动物食道中的粘膜和粘膜下层，清水冲洗干净，并用75%酒精浸泡1～4h消毒，消毒后用PBS缓冲液冲洗干净，将由青霉素与链霉素组成的双抗和曲拉通混合到PBS缓冲液中形成PBS混合液，其中：曲拉通在PBS混合液的重量百分比为1%、青霉素和链霉素在PBS混合液中的浓度均为200U/L，再将上述粘膜及粘膜下层置于该PBS混合液中，振荡并持续涡旋，每12h更换PBS混合液，持续振荡涡旋3天后用含双抗的PBS缓冲液清洗粘膜及粘膜下层，其中：组成双抗的青霉素和链霉素在PBS缓冲液中的浓度均为200U/L，然后将粘膜及粘膜下层在37℃的温度下浸泡在含有DNA酶的PBS缓冲液中2h，其中：DNA酶在PBS缓冲液中的浓度为1000～5000U/L，再用含双抗的PBS缓冲液清洗，其中：组成双抗的青霉素和链霉素在PBS缓冲液中的浓度均为200U/L，得到食道粘膜脱细胞基质；（3）、用三氟乙醇溶解聚己内酯得到聚己内酯溶液、用甲酸溶解丝素蛋白得到丝素蛋白溶液，并将聚己内酯溶液和丝素蛋白溶液按溶质重量比为4：1的比例混合得到混合液，然后以六氟异丙醇为溶剂调节混合液的浓度为0.125μg/ml，并作为电纺丝溶液，取步骤（2）所制备的食道粘膜脱细胞基质作为基底，通过静电纺丝装置将电纺丝溶液在基底内腔表面进行静电纺丝，获得纤维直径为50～500nm、厚度为100～200nm 的多孔纤维膜，然后将此多孔纤维膜连同基底一起浸泡在步骤（1）所制备的基膜蛋白液中，在４℃下浸泡24 h后取出，并以PBS缓冲液冲洗去多余基膜蛋白，得到包被了基膜蛋白的电纺丝/脱细胞基质支架，备用；（4）、将可降解聚酯型聚氨酯溶于1,4‑二氧六环中，配制成重量浓度为5～25%的聚氨酯溶液，将该聚氨酯溶液浇注到带有连续和点断微槽结构的模具上，制备成宽为5～10厘米且带有双面微槽的长方形的聚氨酯薄片，其中聚氨酯薄片的一面为连续微槽，另一面为点断微槽，连续微槽的结构为：槽宽200µm、槽深30µm、槽间距30µm；点断微槽的结构为：槽宽100～200µm、槽深30µm，每个隔断长100～200µm，隔断宽30µm、同一行中相邻两个隔断的间距为30µm，所述的连续微槽和所述的点断微槽互相垂直，且连续微槽的延伸方向为聚氨酯薄片的长度方向，点断微槽的延伸方向为聚氨酯薄片的宽度方向；（5）、从蚕丝或蚕茧中提取丝素蛋白，并在聚氨酯薄片的内外表面以化学方式接上可供反应的自由胺基，然后将接有自由胺基的聚氨酯薄片浸在重量浓度为1～3%的戊二醛溶液中室温反应1～5h，之后用去离子水冲洗去除聚氨酯薄片表面未反应的戊二醛，再将聚氨酯薄片浸入浓度为1mg/ml的丝素蛋白溶液中，在4℃的温度下浸泡12～24h，取出后用PBS缓冲液冲洗去除聚氨酯薄片表面没有反应的丝素蛋白；（6）、将聚氨酯薄片以点断微槽为内表面—点断微槽呈环向、连续微槽为外表面—连续微槽呈纵向包裹于由步骤（3）所制得的包被了基膜蛋白的电纺丝/脱细胞基质支架外，并将聚氨酯薄片纵向缝接成管状，得到具有组织学结构的人工食道；（7）、将制得的人工食道以75%酒精浸泡消毒30分钟，然后以灭菌PBS缓冲液冲洗，无菌保存；（8）、当将所制得的人工食道与人体食道对接时，将人体食道中的病变部位整段切除，按层/层对接的方法，将人工食道与剩余食道组织缝接，即电纺丝/脱细胞基质与食道的粘膜下层缝接，聚氨酯薄片上的点段微槽层与人体食道中的环形肌层对接，聚氨酯薄片上的连续微槽层与人体食道中的纵形肌层对接，逐层缝合伤口，体内培育6～18个月。