发明名称 |
一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法 |
摘要 |
本发明公开了一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法:(1)采集气溶胶样本;(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA;(3)检测:进行PCR扩增;(4)建立标准曲线和溶解曲线:建立阳性标准质粒的标准曲线,以及扩增体系的溶解曲线;(5)判断气溶胶样本中是否含有牛病毒性腹泻病毒。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3~8所示)以及试剂盒(由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH<sub>2</sub>O组成)。本发明的方法,既可用于牛病毒性腹泻病毒气溶胶样本的分型检测,也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测,具有广泛的应用前景。 |
申请公布号 |
CN103981285A |
申请公布日期 |
2014.08.13 |
申请号 |
CN201410188351.X |
申请日期 |
2014.05.06 |
申请人 |
山东省农业科学院奶牛研究中心 |
发明人 |
何洪彬;侯佩莉 |
分类号 |
C12Q1/70(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/70(2006.01)I |
代理机构 |
济南圣达知识产权代理有限公司 37221 |
代理人 |
彭成 |
主权项 |
一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法,其特征在于:步骤如下:(1)采集气溶胶样本;(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA;(3)检测:以上述提取的cDNA为模板,采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR,具体如下:所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH<sub>2</sub>O组成;所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒;所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对;所述通用型检测引物对的序列如下:上游引物RT‑F为5′‑TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA‑3′;下游引物RT‑R为5'‑CCCTATCAGGCTGTATTCGT‑3';所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下:牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对:上游引物RT‑1‑F为5′‑TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT‑3′;下游引物RT‑1‑R为为5′‑GCCTCTGCAGCACCCTATCA‑3′;牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对:上游引物RT‑2‑F为5′‑AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA‑3′;下游引物RT‑2‑R为5′‑GTCTCTGCTACACCCTATCAG‑3′;(4)建立标准曲线和溶解曲线:建立阳性标准质粒的标准曲线,以及扩增体系的溶解曲线;(5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时,若溶解曲线为S型曲线,则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒;若溶解曲线为一条直线,则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒;当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对时,若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型,则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒I型;若溶解曲线为一条直线,则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型;若对应于牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型,则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型;若溶解曲线为一条直线,则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型。 |
地址 |
250100 山东省济南市历城区工业北路159-1号 |