一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法

摘要

一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，涉及发酵生产DHA的方法。采用的菌种为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12。菌种活化与菌悬液制备；一级种子制备；二级固料种子的制备；二级固料种子发酵罐扩大培养；发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。改进种子制备方式，简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，可减少投资，节约成本；同时固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小。

主权项

一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤： 1)菌种活化与菌悬液制备：将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)KDW‑12菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85％的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)KDW‑12，已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.6843； 所述斜面培养基的配方为：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min； 2)一级种子制备：将步骤1)获得的菌悬液按质量分数为1％的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或 将步骤1)获得的菌悬液按质量分数为1％的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子； 所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250～400g/L，所述谷物选自米类、麦类中的至少一种，所述米类选自大米、小米、糙米、玉米中的至少一种，所述麦类选自大麦、小麦、燕麦中的至少一种；所述液体种子培养基的组成为：葡萄糖20～25g/L，氯化钠20～25g/L，磷酸二氢钾0.2～0.5g/L，酵母粉3～5g/L，七水硫酸镁8～12g/L，海盐0.1～0.8g/L，谷氨酸0.2～0.6g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；所述培养的温度为25～28℃，培养的时间为1天； 所述液体营养液组分包括组分1和组分2，所述组分1的组成为：葡萄糖2～5g/L，七水硫酸镁0.2～0.6g/L，磷酸氢二钾1.0～5.0g/L，海盐0.1～0.8g/L，甘氨酸0.2～0.6g/L，苏氨酸1.5～1.8g/L，蛋氨酸2～3.5g/L，苹果酸3～6g/L，加水定容，调节pH值为6～7；所述组分2的组成为：La³⁺10～15mg/L，Ce³⁺1～4mg/L，Sm³⁺2～6mg/L，Nd³⁺8～12mg/L，Mn²⁺0.6～1.2mg/L，Co²⁺0.05～0.1mg/L，生物素0.2～0.6mg/L，浅蓝菌素0.1～0.3mg/L，赤霉素GA2～5mg/L，VB₁₂0.5～1.0mg/L，叶酸0.01～0.05mg/L，余量为水； 所述固料培养基的制备方法为：固态组分与液体营养液组分1混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50％～65％，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2～1.0cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基； 所述固态组分与液体营养液组分1按质量/体积的配比为(5～10)g∶(2～5)mL，其 中固态组分按质量计算，液体营养液组分1按体积计算； 所述固料培养基原料与液体营养液组分2按质量/体积的配比为(10～15)g∶(3～6)mL，其中固料培养基原料按质量计算，液体营养液组分2按体积计算； 3)二级固料种子的制备：一级固料种子以质量百分数为0.85％的生理盐水根据1∶1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液； 在无菌条件下： 按质量分数为10％～20％的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或 按质量分数为8％～15％的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，25～28℃，培养2～3天； 制得二级固料种子； 4)二级固料种子发酵罐扩大培养：二级固料种子加入1:3～5(W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10％～20％的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在25～28℃，利用搅拌转速保持30％～50％的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18～22℃，发酵3～5天，通过重量百分比为28％的氨水控制发酵pH6.0～6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4～8g/L； 所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成为：葡萄糖30～60g/L，NaCl15～20g/L，MgSO₄.7H₂O4～8g/L，酵母粉3～8g/L，KH₂PO₄0.5～1.0g/L，(NH₄)₂SO₄0.2～0.5g/L，NaHCO₃0.8～1.2g/L，CoCl₂1.0～2.0μg/L，MnSO₄0.5～1.0μg/L，VB₁0.05～0.1mg/L，VB₁₂0.001～0.01mg/L，初始pH6.0～7.0；所述发酵的溶氧维持在8％～12％； 5)发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。