一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法，适用于戊糖片球菌的高密度发酵生产。发酵工艺包括种子液制备和发酵罐培养。发酵罐培养阶段包括发酵过程中pH的调节和葡萄糖补料发酵。在发酵过程中通过注入一定浓度的NaOH溶液调节发酵液pH在5.0～6.5范围内，发酵4~6h后间歇补加葡萄糖，培养20~25h结束发酵，此时有效活菌数可以达到90亿/mL。采用本发明的戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵工艺，使戊糖片球菌的菌体量有大幅度提高。

主权项

一种利用戊糖片球菌高密度发酵培养基对戊糖片球菌进行高密度发酵的方法，通过方案一、方案二或者方案三完成；所述方案一的步骤如下：（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备（1）按下列配方备料将蛋白胨15 g、酵母粉8 g、柠檬酸钠3 g、乙酸钠2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.4 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.2，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30 min得培养基；（2）称取葡萄糖10 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下灭菌30 min得葡萄糖溶液；（3）将步骤（2）的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到戊糖片球菌高密度发酵培养基；（二）、3L发酵罐高密度发酵A、发酵种子液的培养  将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有30mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在35℃条件下，180 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；B、补料用葡萄糖溶液的配制称取葡萄糖40 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下蒸汽灭菌30 min得补料用葡萄糖溶液；C、接种将发酵种子液按1%的接种量接入装有1.5 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温28℃，转速120 rpm，通风比0.1 VVM，进行发酵培养；D、发酵液pH值调节及补料发酵戊糖片球菌发酵培养至4 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH值保持在5.0～5.5范围内，直至发酵结束；在发酵培养至4 h时开始补料，向发酵罐中一次补入15 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至20 h结束发酵，此时戊糖片球菌的有效活菌数为50亿/mL，菌体OD₆₀₀是9.0~9.5；所述方案二的步骤如下：（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备（1）按下列配方备料将蛋白胨10 g、酵母粉5 g、柠檬酸钠1 g、乙酸钠1 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、118℃下灭菌25 min得培养基；（2）称取葡萄糖25 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25 min得葡萄糖溶液；（3）将步骤（2）的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到戊糖片球菌高密度发酵培养基；（二）、发酵罐高密度发酵A、发酵种子液的培养将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有40mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在40℃条件下，200 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；B、补料用葡萄糖溶液的配制称取葡萄糖40 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25 min得补料用葡萄糖溶液；C、接种将发酵种子液按4%的接种量接入装液量为1.8 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温32℃，转速200 rpm，通风比0.4 VVM，进行发酵培养；D、发酵液pH值调节及补料戊糖片球菌发酵培养至8 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH保持在5.5～6.0范围内，直至发酵结束；在发酵培养至6 h时开始补料，向发酵罐中一次补入12 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至22 h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为80亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是12.0~12.5；所述方案三的步骤如下：（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备（1）按下列配方备料将蛋白胨10 g、酵母粉10 g、柠檬酸钠3 g、乙酸钠1 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.6，在103.4kPa蒸汽压力、121℃下灭菌20 min得培养基；（2）称取葡萄糖40 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20 min得葡萄糖溶液；（3）将步骤（2）的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到戊糖片球菌高密度发酵培养基；（二）、发酵罐高密度发酵A、发酵种子液的培养将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有50mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下，150 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；B、补料用葡萄糖溶液的配制称取葡萄糖35 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20 min得补料用葡萄糖溶液；C、接种将发酵种子液按5%的接种量接入装液量为2.4 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温37℃，转速300 rpm，通风比0.8 VVM，进行发酵培养；D、发酵液pH值调节及补料戊糖片球菌发酵培养至10 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH使pH保持在6.0～6.5范围内，直至发酵结束；在发酵培养至8 h时开始补料，向发酵罐中一次补入10 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至25 h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为90亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是13.5~14.0。