多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法

摘要

一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法。它以尖晶石和反尖晶石型磁性纳米铁氧体材料为分离基质，利用这些材料中处于八面体结合位点的金属离子与不同磷酸化修饰多肽配位能力的差异，及其固有的磁性，在外磁场作用下实现与复杂样品背景的快速分离。本发明所涉及的磁性纳米铁氧体材料能将复杂多肽混合物分离为非磷酸化肽段、单磷酸化肽段以及多位点磷酸化修饰肽段，减少或消除了不同样品分子之间的信号抑制，能够有效区分体内或离子源内单磷酸化修饰肽段，信噪比高，干扰小。本方法简单，不需要复杂的仪器即可有效富集低丰度磷酸化多肽，实现多位点磷酸化修饰的序贯分离和质谱鉴定，样品分析操作简单，无需复杂的样品前处理。

主权项

一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法，其特征在于，该方法基于NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料对多位点磷酸化多肽的选择性吸附，及纳米铁氧体材料固有的磁性，在外磁场作用下实现不同程度磷酸化修饰多肽的序贯分离，方法步骤包括：化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料，多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集，非特异性吸附清洗，多位点不同程度磷酸化修饰肽段洗脱以及上样分析；   一、化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料，   1）、称取三氯化铁、二氯化铁、硫酸锌和硝酸镍分别置于烧杯中，分别用2M盐酸各配制成1M金属离子溶液；    2)将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液在室温下混合，滴加氨水至pH 11~12,在室温搅拌半小时以上，产生黑色Fe₃O₄；将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液以及5毫升硫酸锌溶液和5毫升硝酸镍溶液在室温下混合，滴加氨水至pH  11~12，在室温下继续搅拌半小时以上，产生NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料；   3)取步骤2）得到的Fe₃O₄和NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料，先后用纯水和乙醇清洗3次，并保存于乙醇溶液中，放置于冰箱保存；   二、多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集：   1）将保存在乙醇溶液中的Fe₃O₄和NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料取出，放置于离心管，先用50wt%乙腈和0.1wt% 三氟乙酸溶液清洗3次，再用0.1wt%三氟乙酸水溶液清洗3次;   2）将蛋白酶解液用三氟乙酸调至pH 1~2, 加入乙腈和三氟乙酸使其最终含有50wt%乙腈和0.1wt%三氟乙酸;   3）将NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料加入步骤2）所得的溶液中，漩涡混合1小时；转移上清液至离心管中,加入Fe₃O₄磁性纳米铁氧体材料漩涡混合1小时；   4）用磁铁分离步骤3）NiZnFe₂O₄磁性纳米铁氧体材料，Fe₃O₄磁性纳米铁氧体材料，弃去上清液；三、非特异性吸附的清洗：   1）、将已富集磷酸化多肽的NiZnFe₂O₄和Fe₃O₄磁性纳米铁氧体材料，分别用含有50wt%乙腈和0.1wt%三氟乙酸的洗涤液清洗3次；2）、用含0.1wt%三氟乙酸的水溶液再清洗3次;四、样品洗脱及上样：   1）、配制1M磷酸铵溶液，将经过第三步清洗的NiZnFe₂O₄和Fe₃O₄磁性纳米铁氧体材料分别悬浮在1M磷酸铵溶液中，漩涡混合3分钟；   2）、分别转移上清液至两个离心管中；3）、重复步骤1）操作，分别合并两次上清液；   4）、用ZipTipC18除盐，并用含50wt%乙腈、0.1wt%三氟乙酸和1M的 2，5‑二羟基苯甲酸溶液洗脱样品；   5）、将样品点在样品靶上，进行质谱分析，分别进行MS全扫描和MS/MS分析，并使用MASCOT搜索引擎将MS/MS图谱与NCBInr数据库进行比对，实现磷酸化肽段的鉴定。