一种兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法

摘要

本发明涉及兔体外单层肝细胞系模型建立方法，以及将其传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法，属于肝细胞体外培养技术领域；本发明旨在寻求一种可以替换代价昂贵的应用动物实验繁殖兔肝球虫病原收集的方法，通过兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法体外建立，能够稳定的实现兔体外肝细胞快速、便捷、经济的传代，以便能够在后续实验中实现体外繁殖球虫病原的目的；本发明通过摸索和研究兔年龄、击杀方式、消化酶的选择、培养方式的选择、消化时间、细胞浓度、血清的选择、培养瓶的选择、湿度的控制及贴壁试剂的筛选等，成功的解决了兔单层肝细胞模型培养的建立并可顺利的传代，并摸索了细胞的冻存及保存的方式。

主权项

一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于包括如下步骤：a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于消毒液中0.5‑2分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；c、消化得到分散的兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化8~15分钟；所述消化液为0.025%胰酶；d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4‑6层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4‑5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，800‑1000r/min离心5‑7分钟；f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入180‑210μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养3‑6天，得到兔体外单层肝细胞系模型；所述步骤b‑d、f均在超净工作台上进行。