一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法

摘要

一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法，属生物医学检测分析技术领域，其特征是通过以混合血清为筛选靶标消除个体差异，先以正常血清反筛去除文库中能与非特异性血清成分结合的核酸序列，再以混合血清正筛继而克隆测序分离核酸适配子，通过对核酸适配子的结构模拟分析、特异性分析、亲和力分析和应用价值分析，优选出应用价值大的核酸适配子。本发明克服了血清中大量非特异性成分的干扰，可以直接以血清为靶标高通量筛选出血清中疾病特异性成分的核酸适配子，既高效又经济，可为建立基于核酸适配子的分析技术并系统性探索疾病的发生发展规律和获取临床诊疗相关的生物信息奠定基础，具有良好的应用价值。

主权项

一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法，其特征是包括以下步骤：a. 收集一组患有被研究疾病的患者的血清标本，等量混合制备成阳性混合血清；同时收集一组不患有被研究疾病的受试者的血清标本，等量混合制备成阴性混合血清；b. 设计单链随机寡核苷酸文库和引物序列，人工合成，用结合缓冲液分别配制成文库和引物溶液；c. 将阴性混合血清与步骤b制备的文库溶液孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收游离核酸，以游离核酸为模板进行PCR扩增并回收和纯化单链寡核苷酸，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育‑回收‑制备，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显减弱、游离核酸条带明显增强时，停止筛选；d. 将阳性混合血清与步骤c最后一轮筛选后制备的亚文库孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收结合核酸，以结合核酸为模板进行PCR扩增，回收和纯化单链寡核苷酸，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育‑回收‑制备，并逐轮增加核酸与血清的量比，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显、游离核酸条带明显减弱趋于消失时，停止筛选；e. 以步骤d最后一轮筛选后制备的亚文库为模板进行PCR扩增，对扩增产物直接进行克隆分离和核酸测序；将测序结果与所设计文库的序列进行比对，将两端固定序列区与文库相同、中间随机序列区长度与文库相同的核酸序列确定为核酸适配子；f. 对步骤e确定的核酸适配子的核苷酸序列进行二级结构的计算机模拟分析，按序列同源性进行聚类分析和家族划分，对同一家族核酸适配子通过同源性比对找出主要基序，选出代表性核酸适配子；g. 将步骤f选出的代表性核酸适配子分别与阴性混合血清和阳性混合血清孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及核酸染色，观察游离核酸适配子带的强弱，采集图像并用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，计算阴性混合血清与阳性混合血清的游离核酸适配子带的灰度比值，选出特异性强的核酸适配子；h. 将步骤g选出的特异性强的代表性核酸适配子配成梯度浓度，与阳性混合血清孵育后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集图像并测定各梯度点结合核酸适配子带的灰度值，计算解离常数Kd，选出亲和力高的核酸适配子；i. 将步骤h选出的核酸适配子分别与单个阳性血清标本和阴性血清标本孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值，计算各标本与核酸适配子对照的灰度比值，统计分析两类标本之间的灰度比值差异以及核酸适配子对阳性和阴性标本的判别能力，选出应用价值大的核酸适配子。