可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法

摘要

可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，包括：应用miRNA微阵列芯片技术获得miRNAs的差异表达谱，并用生物信息学方法和qRT-PCR技术进一步筛选验证，得到可调控ATXN3基因表达的miRNAs；用qRT-PCR技术及Westernblot技术确定miRNAs与ATXN3的靶向作用关系及作用机制；采用双荧光素酶报告基因检测技术确定miR-25与ATXN3基因的靶向作用关系及具体结合位点，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。

主权项

1.可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs为序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的miR-29a-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p和miR-34b-3p；所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法包括以下步骤：（1）准备含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血各5~10ml，分离的血清分装后置于-80℃备用；（2）TRIzol法提取步骤（1）血清中含miRNA的总RNAs；(3）应用miRNA微阵列芯片技术对步骤(2）中的总RNAs进行miRNAs表达谱检测，初步筛选得到SCA3/MJD分子标志物miRNAs；(4）对步骤(3）初步筛选得到的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，应用生物信息学方法和qRT—PCR技术在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中进行验证；(5）上调通过步骤(4）验证的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，利用Westernblot技术检测转染所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs后内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平：①HEK293T细胞培养；②细胞转染：内源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negativemimics100ng、miR-29amimics100ng、miR-34bmimics100ng、miR-125bmimics100ng、miR-25mimics100ng、siATXN3100ng；其转染对象为HEK293T细胞；外源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negativemimics100ng、siATXN3100ng、miR-25mimics100ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；③内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平检测：总蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAGE胶的制备，上样及电泳，转膜，封闭，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，显影及定影；（6）上调及下调步骤（5）明确的SCA3/MJD分子标志物miRNAs表达后，采用qRT-PCR法检测内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平；①HEK293T细胞或SCA3/MJD模型细胞培养；②细胞转染：内源性ATXN3基因表达测定：siATXN350ng、miR-25mimics50ng、negativemimics50ng、miR-25inhibitor100ng、negativeinhibitor100ng、空转染组；其转染对象为HEK293T细胞；外源性ATXN3基因表达测定：negativemimics50ng、siATXN350ng、miR-25mimics50ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；③内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平检测：a)总RNAs抽提；b)总RNAs纯度鉴定；c)总RNAs完整性鉴定；d）逆转录合成cDNA；e）qRT-PCR：以β-actin作为内参照，cDNA序列引物：ATXN3-1F:GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG；ATXN3-2R:TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG；β-actin-1F:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG；β-actin-2R:GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC；f)通过比较目的基因ATXN3和内参基因β-actin的Ct值，应用2-^△△Ct法对所得数据进行处理，计算目的基因ATXN3相对内参基因β-actin的mRNA相对表达量；(7）应用双荧光素酶报告基因检测技术明确SCA3/MJD分子标志物miRNAs调控ATXN3基因的作用靶点；①生物信息学软件预测调控ATXN3表达的miRNA；②构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体；③构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体；④双荧光素酶报告基因活性检测：a)HEK293T细胞培养；b)细胞转染：pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR转染组：pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR150ng+miR-25mimics25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR150ng+negativemimics25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR150ng；pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR转染组：pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR150ng+miR-25mimics25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR150ng+negativemimics25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR150ng；c)双荧光素酶活性分析。