氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用

摘要

氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用。本发明公开了一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat及其构建方法，还公开了该质粒pBV-geneE-cat在大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)菌蜕制备中的应用。本发明氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat由噬菌体PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和原核温控表达载体pBV220组成。本发明构建的质粒pBV-geneE-cat可以在大肠杆菌中稳定的复制，并能够高效表达氯霉素乙酰转移酶，从而产生氯霉素抗性，以此来作为抗性筛选标记，还可高效表达裂解基因E，在制备氯霉素敏感的大肠杆菌菌蜕时裂解效率可达99.998％。

主权项

一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV‑geneE‑cat的构建方法，其特征在于：以噬菌体PhiX174RFI DNA为模板、SEQ No.1和SEQ No.2所示DNA为引物进行PCR扩增，获得噬菌体PhiX174裂解基因E，然后将其与经EcoR I和Pst I双酶切的pBV220载体连接，获得温控裂解质粒pBV‑geneE；将质粒pLysS经Acc II酶切，获得1787bp的包含侧翼调控序列的cat基因，然后用T4DNA ligase将cat基因与经Sca I单酶切的pBV‑geneE进行连接，获得氯霉素抗性温控裂解质粒pBV‑geneE‑cat；所述获得质粒pBV‑geneE‑cat的具体方式为：质粒pLysS经Acc II单酶切，酶切体系为Acc II10U、10×M Buffer2μL、pLysS0.6μg、补水至20μL，37℃酶切1h；琼脂糖凝胶电泳酶切产物，切胶回收条带，获得包含启动子区的氯霉素乙酰转移酶基因cat片段；质粒pBV‑geneE经Sca I酶切，酶切体系为Sca I10U、10×H Buffer2μL、pBV‑geneE0.8μg、补水至20μL，37℃酶切1h；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收条带，获得pBV‑geneE线性化平末端片段；将cat基因片段磷酸化处理，反应体系为T4polynucleotide Kinase12U、cat10pmol、5μL10×T4Polynucleotide Kinase Buffer、补水至50μL，37℃处理1h；将线性化质粒pBV‑geneE去磷酸化，反应体系为Alkaline Phosphatase4U、线性化质粒pBV‑geneE15pmol、10×SAP Buffer5μL，补水至50μL，37℃处理1h；用T4DNA ligase连接去磷酸化的pBV‑geneE片段与磷酸化的cat片段，连接反应体系为T4DNA ligase350U、磷酸化cat片段0.4pmol、去磷酸化pBV‑geneE片段0.03pmol、10×T4DNA Ligase Buffer2.5μL、补水至25μL，16℃反应12h；将连接产物通过热击转化入大肠杆菌DH5α；通过氯霉素和菌液PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定；基因E和基因cat的序列均正确的转化子进行增菌培养，提取质粒，命名为pBV‑geneE‑cat。