利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，本发明具体涉及利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法。所述方法包括步骤：1）棉株叶片的选取；2）高分子量细胞核DNA的提取；3）高分子量DNA的部分消化及两次选择；4）大片段DNA的回收、连接及转化；5）插入片段的检测。该方法适用于构建所有棉花材料的BAC文库，包括种子量少或无种子但宿生保存的棉花材料。

主权项

利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）棉株叶片的收集：选用不需要暗处理的棉株的叶片，摘取田间或花盆正常生长、刚平展的幼嫩棉花叶片；2）提取高分子量细胞核DNA，将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中，然后裂解释放核DNA，具体步骤如下：取叶片40g，迅速转入液氮中研磨约1h，然后将粉末转入400mL预冷的Washbuffer，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01M EDTA Na₂，1mM Spermidine，1mM Spermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇和0.5%TritonX‑100，冰上轻轻搅拌15‑20min，用两层纱布和2层微细滤布过滤到预冷的50mL离心管中，4℃、3200rpm、离心20min，去除上清，如果此次离心沉淀时还有一些绿色沉淀，用毛刷将表层的绿色沉淀轻轻刷出，然后用Wash buffer对沉淀再次悬浮，并且降低离心速度，去除绿色沉淀；向沉淀中加入500μL1×HB，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01MEDTA Na₂，1mM Spermidine，1mM Spermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇，悬浮沉淀，合并各离心管的悬浮液于一个离心管中，向离心管中加满1×HB混匀，4℃、4000rpm、离心15min，用1×HB重复此步骤3次，最后在沉淀中加入不含β–巯基乙醇的1×HB调整细胞核的浓度，将细胞核悬浮液和1.5%的低熔点琼脂糖于45℃水浴5min，然后两者等体积混匀，45℃水浴5min，迅速将混合液加入plug mold中，冰上冷却30min，待其充分凝固后，将胶块放入含有蛋白酶K的裂解液中，蛋白酶K的浓度为1mg/mL，在50℃杂交炉中裂解36h，中间换一次裂解液，去除裂解液，加入含浓度PMSF的50mL预冷的T₁₀E₁₀，其中PMSF的浓度为1mM，T₁₀E₁₀的配方为10mM Tris‑HCl、10mM EDTA，冰上轻轻震荡2次，每次1h，再将胶块放在不含PMSF的T₁₀E₁中冰上清洗4次，其中，T₁₀E₁的配方为10mM Tris‑HCl、1mM EDTA，每次1h，随后将胶块置于T₁₀E₁中，4℃保存备用；3）高分子量核DNA的酶切及两次选择，采用脉冲场凝胶电泳分离，对于第一次选择：脉冲的起始时间10s，第一次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6v/cm，10s‑50s，18h，选出120～300kb的DNA片段，分成120～200kb和200～300kb两个范围进行第二次选择，对于第二次选择：起始和终止时间分别为4s‑4s，第二次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6V/cm，电泳时间14h，选出120～200kb和200～300kb的DNA片段；4）分别对存在于胶块中的120～200kb，200～300kbDNA进行回收，与载体连接，然后转化感受态细胞；5）检测阳性克隆的插入片段是否满足实验需要。