一种生物膜γ-变形细菌的定量检测方法

摘要

本发明涉及一种生物膜γ-变形细菌的定量检测方法，包括以下步骤：标准品γ-变形细菌的预处理；待测生物膜γ-变形细菌样品的预处理；对标准品γ-变形细菌进行实时荧光定量PCR检测，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；再对待测生物膜γ-变形细菌进行实时荧光定量PCR检测得到循环阈值，根据循环阈值及标准曲线得到样品中γ-变形细菌DNA的浓度。与现有技术相比，本发明有效克服了传统纯化培养方法分析速度慢、制约因素多、低估生物多样性、准确性低、主观因素强等问题，以更加科学地监测水处理工艺及管网生物膜中致病菌的信息，反映饮用水系统中的潜在危害，为给水管网的水质净化提供更加科学的依据。

主权项

一种生物膜γ‑变形细菌的定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：第一步、标准品γ‑变形细菌的预处理：(1)将冷冻的γ‑变形细菌标样放入LB液体培养基中，37℃恒温培养，得到复苏的γ‑变形细菌标样；(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；(3)将复苏的γ‑变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养；(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到γ‑变形细菌质粒原液；(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的γ‑变形细菌质粒原液的DNA含量；第二步、待测生物膜γ‑变形细菌样品的预处理：(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；第三步、实时荧光定量PCR检测：(1)标准品γ‑变形细菌的实时荧光定量PCR检测：根据γ‑变形细菌质粒原液的DNA含量，将γ‑变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μl的γ‑变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的γ‑变形细菌质粒稀释液的循环阈值；根据检测结果得到γ‑变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝‑ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；(2)待测生物膜γ‑变形细菌的实时荧光定量PCR检测：根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜γ‑变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中γ‑变形细菌DNA的浓度。