用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法

摘要

一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液体染毒，4）中性红染色，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。通过细胞接种密度的优化步骤，筛查了最佳接种密度下最适用于电子烟烟液毒性评价的细胞系BEAS-2B细胞。并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。本测定方法还具有快速简便、灵敏性高的优点。

主权项

一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）溶液的制备：（1）中性红染液：0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50 μg/ml；（2）中性红萃取液：冰醋酸∶无水乙醇∶水＝1∶50∶49；（3）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），200 μg/ml，100% 细胞致死率浓度；（4）电子烟烟液染毒溶液：使用分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制；2）细胞样本的处理：（1）细胞接种：选用人正常肺上皮细胞BEAS‑2B细胞，向96孔板的每孔中加入100 μL的BEAS‑2B细胞悬液；（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组，阴性对照组每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；（3）中性红染色：电子烟烟液染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μl中性红染液，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养3 h，3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μlPBS洗2次，加入100ul中性红萃取液，室温下快速振荡15‑20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光烟液值；（4）结果与分析：计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率，相对吸光值C= A₅₄₀/ A_{540阴性对照}；此外，所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_{540阳性对照}应小于等于0.3。