一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒

摘要

本发明提供的一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒，方法为革兰氏菌培养——用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原——制备标记羊抗人IgG的胶体金溶液——采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体的存在，从而判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。本发明的试剂盒，改变了传统的微生物检验的不足，将检测过程缩减到10min以内，并且大幅提高了检测的灵敏度和特异性，以满足快速检测革兰氏菌的需要。

主权项

一种快速检测革兰氏菌的方法，其特征在于：分步实施；1）革兰氏菌培养；2）用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原；其中制备革兰氏阳性菌膜抗原：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经冷苯酚抽提用CNB2层析柱层析获得,制备好后，储存在‑80℃低温保存，备用；其中制备革兰氏阴性菌膜抗原：将大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经曲通114表面活性剂抽提，加温至72℃，再在15000rpm离心条件下，离心15min，过滤，取上清液过sephadexG‑200分子筛纯化制得，制备好，储存在‑80℃低温保存，备用；3）将提取的两种抗原及质控血清点在制备好的硝酸纤维膜反应板上；用移液器在硝酸纤维膜的固定位置上分别点入，革兰氏阴性菌膜抗原的2个检测点和1个点入30个正常的混合血清的质控点，点膜量1‑10ul，革兰氏阳性菌膜抗原浓度0.7‑2.2mg/ml，革兰氏阴性菌膜抗原浓度0.3‑0.8mg/ml,点膜后37℃烘烤1h，置4℃冷藏保存，备用；其中硝酸纤维膜经10%的甲醇浸泡10min,取出裁剪，将其安装在垫有吸水垫的PVC反应板的孔中，37℃烘烤2h后使用；其中硝酸纤维膜上的2个检测点和1个质控点从左到右依次按照革兰氏阳性菌膜抗原检测点、正常血清质控点、革兰氏阴性菌膜抗原检测点的次序排列而成；4）采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体，判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。