一种全合成酯类润滑油在土壤基质中的降解分析方法

摘要

一种全合成酯类润滑油在土壤基质中的降解分析方法，其特征在于：选取试验土壤，按土壤中土著微生物种类多少对其分类，将土壤划分出初始自然条件完全相同的四个试验模块，在模块中添加润滑油、活性污泥微生物菌种和液体培养基，完成全合成酯类润滑油的降解过程；其中，测试模块分为多因素降解和非生物降解两种，参照模块为毒性模块，因土壤中自有一部分微生物和有机物，又因测试模块添加了微生物菌种，故增加了中性模块设计，将这部分做空白扣除；降解结束时取样预处理后分别检测并计算残余润滑油的含量，根据降解前后润滑油含量的变化值计算确定其降解率，参照降解率计算结果及平行测定的最大误差范围考察数据的重复性和稳定性。

主权项

1.一种全合成酯类润滑油在土壤基质中的降解分析方法，其特征在于：选取试验土壤，按土壤中土著微生物种类多少对土壤进行分类，将土壤划分出初始条件完全相同的四个试验模块，在模块土壤中添加缺少的土著微生物菌种、活性污泥微生物菌种并补充相应液体培养基，控制试验环境的温度、光照以及土壤湿度，完成全合成酯类润滑油在可控条件下的降解过程，取样预处理后分别检测并计算残余润滑油的含量，根据培养前后润滑油含量的变化值计算确定其降解率，具体方法如下：第1、实验准备；润滑油在土壤基质中的降解试验可选在南方或北方地区土壤中进行，在全合成酯类润滑油的降解试验土壤中，划出四个模块，每个模块的大小为30cm×30cm×30cm，模块间的间隔距离为30cm，同一试验土壤内四个模块的初始自然条件包括土质结构、土壤湿度、土壤酸碱度以及试验周期内的土著微生物种类、数量完全相同；微生物菌种包括土壤中的土著微生物和需要完全添加的活性污泥微生物两大类，南方和北方土壤中能降解润滑油的土著微生物菌种包括恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，短短小芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，棘孢小单胞菌(Micromonospora echinospora)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)共计11个普通菌种，每种菌的浓度平均为1.0×10²～1.0×10³CFU/g，11种细菌的总浓度为1.0×10³～1.0×10⁴CFU/g，试验前先分析土壤中可降解润滑油的土著微生物种类，根据土壤中土著微生物种类多少将试验模块区分为全部含有上述11种土著微生物的土壤和部分含有上述11种土著微生物的土壤两类，试验土壤不再以地域划分，对后者补充上述11种微生物中缺少的相应菌种，使土壤中具有上述11种微生物，各种细菌的接种量为1.0×10²～1.0×10³CFU/g，接种后土壤中土著微生物总浓度为1.0×10³～1.0×10⁴CFU/g，需要完全添加的活性污泥微生物来源于从污水处理厂生化池取得且经过滤去除杂质的新鲜活性污泥滤液，其优势菌为生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)、垂丝状动胶菌(Zoogloea filipendula)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，食醋丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)，水生丛毛单胞菌(Comamonas aquatica)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)和粪产碱杆菌(Alcaligenes feacalis)共计9个常见菌种，接种菌液的活菌浓度为1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/mL，接种后土壤中总活菌浓度为1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/g；微生物所需营养物质中的无机盐成分除来源于土壤以外，还需要每周一次定量补加无机盐基础培养基溶液，无机盐基础培养基溶液是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/L水溶液计分别为KH₂PO₄3.4、Na₂HPO₄1.5、(NH₄)₂SO₄4.0、MgSO₄·7H₂O0.7、酵母粉0.01，余量为水，培养基的pH值为7.2～7.6，微生物生长所需主碳源来源于全合成酯类润滑油，但润滑油并非唯一碳源，因土壤中自有一些有机物成分，也为微生物提供一部分碳源，土壤中自有的有机物成分包括碳水化合物、木素、蛋白质类、蜡质、脂质、单宁、腐殖质在内，应在润滑油降解率计算中作空白扣除；光源及光照强度为试验环境中的自然光，光照强度为10⁵±100Lux，光线波长范围为全波长；样品预处理中所用水的纯度最低为双蒸水且可溶性总有机碳少于1×10^-3g/L；所用试剂纯度为分析纯至色谱纯；实验用玻璃容器均用洗液洗涤干净以确保容器内壁不含有碳氢化合物；第2、两类样品降解培养法；润滑油土壤基质降解试验分为一个降解周期样品和0天样品：第2.1、一个降解周期样品土壤基质降解过程依据上述分类方法将试验模块区分为全部含有上述11种土著微生物的土壤和部分含有上述11种土著微生物的土壤两类，对后者补充上述11种微生物中缺少的相应菌种，使土壤中具有上述11种微生物，每种菌的接种浓度为1.0×10²～1.0×10³CFU/g，接种后土壤中土著微生物数量达到1.0×10³～1.0×10⁴CFU/g；A.测试样品多因素降解过程：对全部含有上述11种土著微生物的模块一接入20.0mL全合成酯类润滑油和上述微生物菌种即新鲜活性污泥滤液10.0mL，再接入50.0mL上述无机盐基础培养基溶液，将上述润滑油、活性污泥菌液和无机盐溶液与土壤混合均匀，以后每隔7天补加上述无机盐培养基溶液一次，共补加3次，每次用量50.0mL，控制土壤湿度≥80%，必要时补以双蒸水，于30℃±1℃、上述自然光照下降解培养28天后取模块土壤总量的1/10，相当于取润滑油总量的1/10，将土壤样品按以下第3步所述方法进行预处理及检测；B.测试样品非生物降解过程：对全部含有上述11种土著微生物的模块二接入20.0mL全合成酯类润滑油和50.0mL上述无机盐基础培养基溶液，不接入活性污泥菌种，另接入10.0mL0.03M HgCl₂溶液，以抑制土壤中所有土著微生物的生长，将上述润滑油和无机盐溶液与土壤混合均匀，以后每隔7天补加上述无机盐基础培养基溶液一次，共补加3次，每次用量50.0mL，控制土壤湿度≥80%，必要时补以双蒸水，于30℃±1℃、上述自然光照下降解培养28天后取模块土壤总量的1/10，相当于取润滑油总量的1/10，将土壤样品按以下第3步所述方法进行预处理及检测；第2.2、0天样品配制C.中性样品配制：在上述一个降解周期样品降解过程中，对全部含有上述11种土著微生物的模块三土壤同步接入上述无机盐培养基溶液，共接4次，每次接入量50.0mL，控制土壤湿度≥80%，必要时补以双蒸水，于30℃±1℃、上述自然光照下静置28天，待上述一个降解周期样品降解过程结束时取模块三土壤总量的1/10，记为x；然后补足模块中的土样量，再接种上述微生物菌种即新鲜活性污泥滤液10.0mL，混匀，立即取模块土壤总量的1/10，记为y，将x、y分别按以下第3步所述方法进行预处理及检测；D.毒性样品配制：在上述一个降解周期样品降解过程中，对全部含有上述11种土著微生物的模块四土壤同步接入上述无机盐培养基溶液，共接4次，每次接入量50.0mL，控制土壤湿度≥80%，必要时补以双蒸水，于30℃±1℃、上述自然光照下静置28天，待上述一个降解周期样品降解过程结束时，在全部含有上述11种土著微生物的模块四中接入全合成酯类润滑油20.0mL和0.03M HgCl₂溶液10.0mL，与土壤混匀，然后立即取模块土壤总量的1/10，相当于取润滑油总量的1/10，将土壤样品按以下第3步所述方法进行预处理及检测；对部分含有上述11种土著微生物的试验土壤除了在A、B、C、D四个模块中补充上述11种微生物中缺少的相应菌种以外，各模块其余操作都和全部含有11种土著微生物的模块完全相同；第3、样品预处理及检测；将上述A、B、C、D四组土壤样品分别用200mL双蒸水溶解后同步进行超声波破碎细胞，破碎时间为5min～8min，用100mL CCl₄进行萃取，剧烈振荡8min～10min，静置分层，共分三层，最下层是土样沉淀，中间是有机相，上层是水相，弃下层沉淀，取有机相和水相，再次剧振8min～10min，静置分层，收集此次萃取液下层有机相，加入10g无水Na₂SO₄干燥24h，取样，进行红外光谱分析，于C-H键的红外波数2930cm^-1±10cm^-1处分别定量检测各C-H化合物的剩余含量；对上述四个模块样品的超声波破碎操作必须同步进行，相应的取样和检测操作也分别同步进行；第4、土壤基质中全合成酯类润滑油的降解率计算分为两部分；第4.1、土壤基质中润滑油的总降解率计算：第4.2、非生物降解因素作用下的润滑油降解率计算：其中，r_样--A组/模块一测试样品的C-H化合物残余含量的红外光谱值，其中一部分为残余润滑油的红外光谱值，另一部分为土壤中土著微生物、土壤有机物和活性污泥微生物三者含量之和的红外光谱值即ry，r_非--B组/模块二非生物降解样品的C-H化合物残余含量的红外光谱值，其中一部分为残余润滑油的红外光谱值，另一部分为土壤中土著微生物、土壤有机物二者之和的红外光谱值即r_x，r_x--C组/模块三接入活性污泥菌种前土壤中C-H化合物即土壤中土著微生物和土壤有机物总含量的红外光谱值，r_y--C组/模块三接入活性污泥菌种后土壤中的C-H化合物即土壤中土著微生物、土壤有机物和活性污泥微生物三者含量之和的红外光谱值，r_毒--D组/模块四毒性样品的C-H化合物含量的红外光谱值，其中一部分为残余润滑油的红外光谱值，另一部分为土壤中土著微生物、土壤有机物二者之和的红外光谱值即rx。