基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法

摘要

本发明涉及基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类，特别是猪肉成分含量的方法。本发明提供了检测混合肉制品中猪肉成分含量的实时荧光PCR猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针。另外，本发明还提供了含有上述猪特异性引物和探针以及脊椎动物通用引物和探针的检测试剂盒。采用本发明方法能够简便、快捷、准确地检出生肉或熟试样中猪源性DNA成分含量。本发明建立在猪特异性引物体系与通用引物体系扩增曲线的相关关系上，具有较高的准确性和抗干扰能力。此外，本发明具有较强的可移植性，通过更换特异性引物体系可检测混合肉样中其它物种成分的含量。

主权项

1.一种基于RT-PCR测定混合肉制品中猪肉成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg（纯猪肉样品浓度）为横坐标，以（C_t纯猪肉-C_t通用′′）为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₂、截距为C₂；2）以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测猪肉}和C_t通用′′′，通过下式计算得到该混合肉制品中猪肉的成分百分含量：其中，步骤1）和步骤2）中所述猪特异性寡核苷酸引物和探针为：上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’；或5’-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’；探针为：5’-F-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团；步骤1）和步骤2）中所述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针为：上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；探针为：5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团；其中，步骤1）中C_t通用′′表示以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针进行RT-PCR扩增获得的C_t值；C₂表示以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg（纯猪肉样品浓度）为横坐标，以（C_t纯猪肉-C_t通用′′）为纵坐标，所绘制的标准曲线的截距；步骤2）中C_t通用′′′表示以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增获得的C_t值。