一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法

摘要

本发明涉及一种用黑莓组培苗叶片离体循环再生的方法。其特征在于：以黑莓试管苗的叶片为外植体，诱导形成愈伤组织，从愈伤组织诱导分化不定芽，对不定芽进行继代增殖、壮苗培养和生根诱导，最后进行炼苗移栽。此解决方案愈伤组织诱导率达100％，分化率达64.4％以上，不定芽的增殖倍数可达5.74，生根率最高可达100％，平均生根数3.61，移栽成活率达96.9％。本发明利用取材方便和材料丰富的组培苗的叶片为外植体，建立黑莓叶片离体再生体系，同时利用不同阶段形成的不定芽苗为母本，多方位获取叶片，从而形成黑莓叶片多重循环离体再生体系，成功解决了黑莓组培苗叶片再生难的问题。

主权项

一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法，其特征在于包括以下步骤：①大田黑莓茎段外植体的获取、消毒，②茎段不定芽的诱导发生，③不定芽的继代培养；④不定芽苗叶片的循环使用；⑤不定芽的生根诱导；⑥试管苗的炼苗、移栽；所述步骤②中不定芽诱导培养基为：MS+6‑BA(0.3~0.5) mg/L + ZT (0.5~1.0) mg/L +蔗糖(25~30)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；所述步骤③中继代增殖培养基为：MS+TDZ0.05 mg/L +蔗糖(25~30)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；所述步骤⑤中生根培养基为：1/2MS+NAA(0.03~0.1) mg/L +蔗糖(20~25)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；所述步骤④包括以下步骤：（1）组培芽苗及其叶片的选择：选步骤③中继代2次以上的组培芽苗作为循环使用的叶片离体再生材料，当组培芽苗长至3叶以上时，选择最长边×最宽边为0.5 cm×0.5 cm以上的叶片，去掉边缘，剪成(0.4~0.8) cm×(0.4~0.8)cm大小的叶块；（2）诱导叶片形成愈伤组织：将步骤（1）修剪好的叶片背面紧贴于培养基表面，先在温度(25±3) ℃的条件下暗培养(10~15) d，当叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒时，转到光照度(1000~2000) lx、光照时间(12~14) h/d的条件下，培养(15~20) d后形成淡黄色、致密的愈伤组织；所述的诱导叶片形成愈伤的培养基为：MS+ TDZ (0.1 ~1.0) mg/L +蔗糖(25~30)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；（3）诱导愈伤组织分化不定芽：将步骤（2）所得愈伤组织取下，切成(0.3~0.6) cm×(0.3~0.6) cm的块状，接种到愈伤组织分化培养基上，在培养室温度(25±3) ℃、光照度(1500~ 3000) lx、光照时间(12~14) h/d的条件下培养 (25~35) d；所述的愈伤组织分化培养基为：MS+6‑BA1.5 mg/L+IAA0.3 mg/L +蔗糖25 g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；（4）不定芽的继代增殖：将步骤（3）获得的不定芽转接于继代增殖培养基中，在培养室温度(25±3) ℃、光照度(1500~ 3000) lx、光照时间(12~14) h/d的条件下培养 (20~30) d；所述的继代增殖培养基为：MS+6‑BA(0.5~2.0) mg/L+蔗糖(25~30)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2；（5）不定芽的壮苗培养：将步骤（4）中株高大于1.5 cm的不定芽转接于壮苗培养基中，在培养室温度(25±3) ℃、光照度(1500~ 3000) lx、光照时间(12~14) h/d的条件下培养 (15~20 )d；所述的壮苗培养基为：MS+6‑BA(0.3~0.5) mg/L+NAA(0.05~0.2) mg/L +蔗糖(20~25)g/L+琼脂5.6 g/L，pH值5.8~6.2。